黑曲霉脂肪酶的性质研究

《中国生物工程杂志杂志》2014年第七期

1方法

1．1蛋白质浓度测定采用Lowry法，以牛血清白蛋白(BSA)为标准品。

1．2橄榄油乳化取10ml橄榄油与7．5ml5%TritonX-100混合，借助超声波破碎仪(Dutycycle:30%Outputcontrol:40%)乳化7．5min。

1．3脂肪酶活性测定和活性单位定义游离脂肪酶活性:参照TOYOBO公司方法并做改良。取1ml底物(乳化橄榄油与0．1mol/LpH4．0柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液按照1∶4的比例混合)与50μl酶液混合，于50℃孵育并准确反应10min，加入1ml0．4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液终止反应。将反应液12000g离心5min，取50μl上清液与1ml显色液(50UGK、125UGPO、75UPOD、0．5ml2%MgCl2•6H2O、0．5mlATP-Na•3H2O、0．2ml0．5%4-氨基安替比林和0．5ml40mmol/LTOOS依次溶于50mlpH6．550mmol/LMES缓冲液)混合，37℃反应30min，在555nm处测定其光吸收值。固定化酶活性:称取适量的固定化脂肪酶干粉与0．85ml0．1mol/LpH4．0柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液混合，浸泡10min后加入0．2ml乳化橄榄油开始反应，其它操作过程同游离脂肪酶活性测定。酶活性单位(U)的定义:在上述条件下，每分钟催化生成1μmol甘油所需的酶量为一个活力单位。

1．4脂肪酶的固定化取适当稀释的0．4ml酶溶液、0．1ml1．0mol/LNaF、0．2ml4%聚乙烯醇、ddH2O和硅烷试剂混合，在漩涡震荡仪上剧烈震荡5s并轻摇20s，置于冰水中10min后凝胶形成，室温下直立放置24h，真空抽气干燥4h后于37℃孵箱自然干燥。将干燥的凝胶研成细微粉末，加入5mlpH7．50．1mol/L磷酸缓冲液，置于摇床上震荡1h，过滤，收集滤液并重复洗一次，收集滤液。再加入5ml丙酮，震荡1min，抽滤，粉末于37℃孵箱自然干燥12h，称重，室温保存备用。

1．5固定率的测定采用Lowry法测定洗涤滤液的蛋白含量，按公式:固定率=(总蛋白量－滤液中总蛋白量)/总蛋白量×100%计算。

1．6固定化脂肪酶相对活性固定化脂肪酶活性所占同等质量的游离脂肪酶活性的比例作为固定化脂肪酶的相对活性，并定义相同质量的游离脂肪酶活性为100%。按下列公式计算:OD550固:测定固定化脂肪酶活性的显色液在550nm的光吸收值;OD550游:测定游离脂肪酶活性的显色液在550nm的光吸收值;m1:固定化脂肪酶的总质量;m2:测定游离脂肪酶活性时游离脂肪酶的蛋白质量;m3:测定固定化脂肪酶活性时固定化脂肪酶的质量;m4:加入固定的总脂肪酶的蛋白质量。

1．7底物浓度对固定化脂肪酶活性的影响以乳化橄榄油为底物，橄榄油浓度设置为2．85mmol/L～114．03mmol/L，在pH4．0和50℃条件下考察游离脂肪酶与固定化脂肪酶活性，通过Lineweaver-Burk双倒数法作图求其Km值。

1．8pH对固定化脂肪酶活性的影响以乳化橄榄油为底物，在pH3．0～12．0(pH3．0～pH6．0为柠檬酸-柠檬酸钠，pH7．0～pH8．0为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，pH9．0～pH12．0为甘氨酸-氢氧化钠)0．1mol/L缓冲液和最适温度50℃下测定酶的相对活性，与游离脂肪酶比较考察pH对固定化脂肪酶的影响。

1．9温度对固定化脂肪酶活性的影响以乳化橄榄油为底物，在最适pH4．0和35℃～75℃条件下，与游离脂肪酶比较考察温度对固定化脂肪酶的影响。

1．10固定化脂肪酶稳定性酸碱稳定性:将游离脂肪酶与固定化脂肪酶在4℃和不同pH条件下处理6h，然后以乳化橄榄油为底物，在最适温度50℃和最适pH4．0条件下测定游离脂肪酶与固定化脂肪酶活性。温度稳定性:将游离脂肪酶和固定化脂肪酶分别在pH6．0和不同温度(60℃、65℃、70℃和75℃)下孵育不同时间，然后在最适温度50℃和最适pH4．0条件下测定酶活性。固定化脂肪酶反复使用稳定性:将2g固定化脂肪酶粉末与4ml0．1mol/LpH4．0柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液混合装入微型层析柱，并用同样的缓冲液平衡层析柱。将柱置于50℃保温箱中，以2．0ml/min流速用蠕动泵循环打入16ml底物(由10ml乳化橄榄油和6ml0．1mol/LpH4．0柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液组成)于柱中，循环0．5h。将柱中反应液全部打出并收集备用。将每次反应液10000g离心5min，吸取20μl上清加入1ml显色液中，37℃保温30min，于550nm测定光吸收值。保存稳定性:将固定化脂肪酶分装，封口，置于室温避光保存。以乳化橄榄油为底物，间隔15d测定固定化脂肪酶活性。

2结果与分析

2．1硅烷试剂对固定化脂肪酶的影响本文选取了TMOS、MTMS、ETMS和PTMS4种硅烷试剂作为前驱体，分别对黑曲霉脂肪酶进行固定化。经测定各种配方的固定率与相对活性见表1，从表中可以看出，前驱体为PTMS∶TOMS=5∶1时，固定率最高，但固定化酶活性有所损失，相对活性只保留了66．5%;前体为ETMS/TMOS=5∶1时，固定化对脂肪酶有激活作用，相对活性高达136．3%，故以下实验将此固定化酶样品作为测试对象探讨其基本特性。另外也观察到，前驱体仅为TMOS时，在固定化过程中，凝胶过程瞬间完成造成凝胶不均一而且大量放热使脂肪酶失活。而前体仅为ETMS或PTMS时，溶胶难以形成凝胶，需加入一定的TMOS可加速凝胶成型。

2．2水与硅烷分子比对固定化脂肪酶的影响对固定化脂肪酶活性有重大影响的另一个因素是水与硅烷的分子比例。在以ETMS/TMOS=5∶1为前驱体的固定化过程中加入不同量的水，测定其相对活性结果见图1，可以看出在水与硅烷分子比例较低时，固定化酶的相对活性较低，究其原因可能是由于水分子太少时，整个溶胶体系分散不均匀;在水与硅烷分子比例大于10时，固定化酶活性开始降低，这可能是与凝胶时一些水分子不能凝入胶体中使得溶于这部分水的脂肪酶未能固定入胶体内有关。

2．3固定化脂肪酶米氏常数(Km)的测定以乳化橄榄油为底物，在pH4．0、50℃时测定游离脂肪酶与固定化脂肪酶在不同底物浓度下的相对活性。通过Lineweaver-Burk双倒数法作图求得游离脂肪酶与固定化脂肪酶的Km值分别为2．789×10-4mol/L和1．899×10-4mol/L(图2)。脂肪酶在固定化之后Km有所降低，提示脂肪酶经固定化后，对乳化橄榄油的亲和性增加，这可能是由于固定材料的疏水性使得底物更易接近酶活性中心。

2．4pH对固定化脂肪酶活性的影响以乳化橄榄油为底物，在不同pH环境和50℃条件下，pH对游离脂肪酶与固定化脂肪酶的活性的影响结果见图3，从图中可以看出，游离酶与固定化酶的最适反应pH均为pH4．0，但游离酶仅在pH4．0左右狭小范围内具有较高活性，而固定化脂肪酶却能在pH4．0～pH5．5较广范围内保持95%以上的相对活性。

2．5温度对固定化脂肪酶的影响以乳化橄榄油为底物，在pH4．0和不同温度的条件下，温度对固定化脂肪酶与游离脂肪酶的活性的影响结果见图4，从图4中可以看出，固定化酶和游离酶的最适反应温度分别为60℃和50℃，固定化脂肪酶的最适反应温度较游离脂肪酶提高了10℃。

2．6固定化脂肪酶的酸碱稳定性以乳化橄榄油为底物，将游离脂肪酶与固定化脂肪酶在50℃和不同pH缓冲液中处理6h，然后在最适pH4．0下测定反应活性，结果见图5。脂肪酶在固定化之后，它的酸碱稳定性显著被提升，在所测试的广泛酸碱范围内(pH4．0～pH12．0)均能保持活性不变，这为其在工业应用上提供了具有说服力的实验依据。

2．7固定化脂肪酶的温度稳定性以乳化橄榄油为底物，将游离脂肪酶与固定化脂肪酶在最适pH6．0和不同温度下处理不同时间，然后图5在4℃和不同pH条件下处理6h的固定化脂肪酶酸碱稳定性Fig．5pHstabilityofimmobilizedlipasetreatedat4℃indifferentpHfor6h:Indicatedimmobilizedlipase;■:Indicatedfreelipase在最适条件下测定残余酶活性，获得的结果见图6。结果显示游离脂肪酶与固定化脂肪酶在60℃处理后均可显示较好的热稳定性;在65℃和70℃处理后，固定化酶的热稳定性优于游离脂肪酶;在75℃处理后，两者热稳定性没有明显的差异。

2．8固定化脂肪酶反复使用和保存稳定性以乳化橄榄油作为底物，分析不同使用次数后固定化酶活性，获得实验结果见图7所示，从图7中可以看出固定化酶在重复使用12次后仍能保留71．7%活性，但其活性随着反复使用次数的增加而有所降低，可能是在反复使用中对脂肪酶的活性中心造成了伤害。将固定化脂肪酶置于室温密封保存，间隔15d测定其保留的酶活性，结果见图8。从获得结果可以反映出，随着保存时间的延长，固定化脂肪酶活性有所下降，在保存180d后仍能保留79．2%活性。

3讨论

本文以几种硅烷试剂作为前体，采用溶胶凝胶法进行了黑曲霉脂肪酶固定化研究。优化了固定化方法并测定了固定化酶的基本性质。在溶胶过程中，脂肪酶被包埋于溶胶，形成的二氧化硅骨架网中的空间刚好适合脂肪酶的大小，既不会挤压脂肪酶使之空间构象发生改变，也不会空间过大使脂肪酶容易脱落［8］。固定率达到了80．2%，究其原因可能是在固定化时一些脂肪酶固定在了凝胶表面或者吸附在了凝胶表面，在用水溶液和有机溶液清洗时掉落［9］。固定化脂肪酶的活性相对于游离脂肪酶有所提高，可能的原因有四点:第一，脂肪酶在凝胶中充分地被分散和分布;第二，脂肪酶中疏水性结构域与载体材料中的有关疏水基团发生相互作用，导致脂肪酶比活增强;第三，脂肪酶固定化后Km值降低，表明固定化脂肪酶对乳化橄榄油的亲和性增强;第四，载体材料中的PVA的有关基团提供了亲脂性环境，提高了脂肪酶的活性中心的催化能力［10］。Dosanjh等［11］报道，用不同的载体通过吸附法固定脂肪酶，其最高相对活性可达98%，但是在24h后会有10%左右的活性被丢失。相对而言，本文采取的固定化方法能保证脂肪酶得到更高的相对活性。固定化脂肪酶较非固定化酶具有许多优势，在一定的反应pH范围和反应温度范围能够保持高活性。固定化脂肪酶在碱性条件更稳定，可能是因为疏水性骨架网络将脂肪酶较紧密地包裹，使得酶只能形成一层或两层水分子构成的水化层，所以溶液中H+浓度发生大的改变也只能对脂肪酶造成较小的影响。固定化脂肪酶在70℃、75℃时更加稳定，可能二氧化硅骨架网络可以随着酶的构象改变而改变并有助于其恢复自然构象。这些性质都提示固定化脂肪酶有更广泛的应用前景。

作者：李刚锐李林俐范翔孟延发单位：四川大学生命科学学院/生物资源与生态环境教育部重点实验室