鱼类卵母细胞玻璃化冻存的研究进展及前景展望

摘要 玻璃化冻存是指利用一种或多种高浓度冷冻保护剂（即玻璃化液）保护待冷冻的生物材料，直接投入液氮中进行冻存的方法。近年来，鱼类卵细胞和胚胎的低温和超低温保存研究引起人们重视。本文针对现阶段研究进展及存在的主要问题进行综述，并对鱼卵细胞常用活性检测方法进行汇总。

关键词 鱼卵细胞；玻璃化冻存；影响因子；活性检测

中图分类号 S917.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）06-0240-03

Research Progress and Prospect of Fish Oocytes Vitrification

ZHANG Hai-min 1 JIANG Hong-qiang 2 YU Xiao-yi 3

（1 Zhejiang Agriculture and Forestry University，Lin′an Zhejiang 311300； 2 Zhejiang Medical Instrument Research Institute；

3 Ningbo Institute of Science and Engineering，Zhejiang University）

Abstract Vitrification means pretecting frozen biological meterials by using one or more of high-concentration cryoprotectants，then crypreserve in liquid nitrogen directly. Cryopreservation of oocyte can provide sources of oocytes for the embryo engineering technology，such as external fertilization，nuclear transfer，transgenosis. It is vital to establish seed bank for breeding stocks，rare animals and endangered species，solve fertility problems for infertile women. So research on oocyte cryopreservation is of great signification.In recent years，researchers attact great importance to the studies on low-temperature of fish oocytes and embryos. This article summarized current research progress and existing main problems，and collected the detection method of fish oocyte.

Key words fish oocyte；vitrification；influential factors；detection methods

生物细胞、组织、器官、胚胎甚至个体在超低温（-196 ℃）状态下代谢完全停止，生命因此得以长期保存。慢速冷却法作为传统的低温保存方式，深受冷却速率的影响[1-4]，冷却速率过快或过慢，均会对保存的细胞及组织造成损伤[5]。所谓玻璃化冻存，是生物材料低温冻存中的一种方式，具体指利用一种或多种高浓度冷冻保护剂（即玻璃化液）保护待冷冻的生物材料，直接投入液氮中进行冻存的方法。在此过程中，细胞内的液体转变为非晶体的玻璃态，其内部无晶体或仅少量结晶形成，从而防止冰晶的形成而减小对生物材料的损伤[6]。之后，细胞在一定的复温条件下重新复活，从而达到种质资源保存和应用的目的[7-8]。

1 研究进展

自1985年小鼠胚胎玻璃化冻存获得成功之后[9]，哺乳动物的卵母细胞、、胰岛、胚胎神经细胞以及各阶段胚泡等也相继获得成功[10]。但卵细胞因体积较大，结构和组分较复杂，抗冻能力较低，其冷冻保存仍不尽人意[11]。目前仅有一些啮齿类或牛卵细胞，或是卵巢组织冷冻保存成功的报道，但各实验室间的试验结果有很大的差异[12-15]。由于鱼类卵母细胞的细胞膜渗透性低[16-17]及卵母细胞高度的低温敏感性[17-19]，大大影响了鱼类卵母细胞玻璃化冷冻的研究进展。目前尚没有鱼类卵母细胞成功进行低温保存的报道[20]。M.Guan等在斑马鱼卵母细胞玻璃化冻存的研究中发现，斑马鱼卵母细胞使用V3、V4玻璃化液、KCl缓冲液中具有较低的毒性和较好的冷冻效果，然而经台盼蓝染色后发现，冷冻复温后的卵母细胞存活率显著低于冷冻前，因此复温方式的优化还有待进一步解决[21]。目前，鱼类卵细胞和胚胎的低温和超低温保存研究已经引起人们高度的重视[22]。

2 影响鱼卵细胞玻璃化冻存的主要因子

2.1 卵膜的通透性、预平衡时间及玻璃化液的浓度和种类

鱼类卵膜的通透性是影响鱼类卵细胞玻璃化冻存的一个重要限制因子[7]，由于卵膜的通透性差，且有卵黄的存在，将鱼卵细胞置于玻璃化液中预平衡时，如果时间太短，玻璃化液不能完全进入卵细胞内，影响冻存效果，然而如果置于玻璃化液中时间太久，玻璃化液自身毒性可造成鱼卵细胞死亡。因此，研究鱼卵细胞内水分分布及提高卵膜通透性、使用合适的玻璃化液浓度和种类降低玻璃化液毒性可有力克服障碍，是成功冻存鱼卵细胞的前提条件。1988年，Agre等在红细胞膜上发现水通道蛋白后[23]，Delgado等将水通道蛋白3的cRNA注射于青卵细胞中并表达，研究结果证明注射后卵膜对水的渗透性提高2倍，甘氨酸达到（2.20±1.29）cm/min、乙二醇达到（2.98±0.36）cm/min、肾上腺素达到（3.93±1.70）cm/min、二甲基亚砜达到（3.11±0.74）×10-3 cm/min，相比正常卵母细胞均显著提高[24]。此外随着科学技术的不断发展，也有研究者将显微注射技术[25-27]、飞秒激光脉冲技术[28]、超声波空化技术[29-31]应用于玻璃化冻存的研究中，也取得一定成效。

2.2 卵细胞冷敏感性

在鱼类胚胎的冷冻过程中发现，卵黄囊是鱼类胚胎的冷敏感性关键部位，卵黄外由卵黄合胞体层包围，通透性差，阻碍了抗冻剂进入卵黄，在冷冻过程中产生冰晶对胚胎造成损伤。Liu等利用显微注射法对斑马鱼6体节期胚胎进行部分卵黄去除，冷冻后发现其存活率及低温耐受性均显著高于正常胚胎[25]。武鹏飞等研究了显微注射抗冻剂种类、抗冻剂的注射剂量、注射浓度、以及抗冻剂注射后牙鲆胚胎的冷敏感性影响，发现显微注射后胚胎的冷敏感性有一定的降低[32]。同样，鱼卵细胞也具有高度的冷敏感性，如果将显微注射技术应用于鱼卵细胞中，是否可以降低卵细胞冷敏感性，这一问题亟待解决。

2.3 冷冻后复温及玻璃化液洗脱

复温是指在鱼卵细胞置于液氮中冻存后，采用特定方式使其恢复至正常温度的过程，该过程是降温的逆步骤，在冷冻降温中可能出现的一些损伤效应，在复温过程中同样存在（如细胞内冰晶的形成），目前报道的主要有快速复温（40～150 ℃/min）和慢速复温（2～8 ℃/min）[7]，但是这2种复温方式在不同的细胞冻存中表现出不同的效果[33-35]。另外，胡军祥等在大鼠胚脑细胞玻璃化冻存的研究中，采用微波复温和水浴复温相比，其结果表明采用微波复温可有效提高细胞复温速率，且对细胞的损伤明显小于水浴复温[36]。

此外，鱼卵细胞在冷冻前预平衡期，吸收大量的玻璃化液，其细胞内渗透压极大升高，如果直接将冻存后卵细胞置于水中，细胞可能吸水过多而破裂。因此，采用合适的洗脱液种类和浓度梯度也是影响冻存后细胞活性的重要影响因子。

3 常用的酶活性测定判断冷冻效果

3.1 比色法测定卵母细胞ATP酶活性

ATP酶可催化ATP水解生成ADP及无机磷的反应，常通过测定反应释放的无机磷量或ATP的减少量以及pH值变化等来测定ATP酶的活力。酶活力单位定义为每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1 μmol无机磷的量为1个ATP酶活力单位（U）。

3.2 钼酸铵法测定卵母细胞肌酸激酶（creatine kinase，CK）

CK催化肌酸和ATP之间高能磷酸键转换生成磷酸肌酸和ADP的可逆反应。磷酸肌酸生成后很快全部水解为磷酸，此时三磷酸腺苷和二磷酸腺苷仍稳定，加入钼酸铵形成磷钼酸，可进一步还原成钼蓝，根据生成无机磷的量可计算出酶的活力。根据标准曲线计算得出CK活力。

3.3 MTT法测定琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）

活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够还原MTT，生成甲H（蓝色或蓝紫色，不溶于水），经异丙醇作用颗粒溶解显色。甲H生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度570 nm处OD值推测出活细胞的数目。酶活力单位定义为1 mg蛋白1 min使反应体系的吸光度降低0.01为1个比活性单位（U）。

3.4 紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶（llactate dehydroge-nase，LDH）

LDH可催化乳酸与丙酮酸之间的氧化还原反应，通过测定NADH的吸光值可以反应出LDH酶活力。酶活力单位定义为每克组织蛋白37 ℃与基质作用15 min，在反应体系中产生1 μmol丙酮酸为1个单位（U）。

3.5 氮蓝四唑（NBT）显色法测定超氧化物歧化酶（supero-xided，SOD）

NBT显色法，通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生O2-，将氮蓝四唑还原为蓝色的甲H，甲H在560 nm处有强吸收。而SOD可清除O2-，从而抑制甲H形成。反应液蓝色的深浅可以反映超氧化物岐化酶活性的高低。酶活力单位定义为1 mg组织蛋白在1mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个SOD活力单位（U）。

3.6 过氧化氢酶（catalase，CAT）

CAT属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢，即可求出消耗的H2O2的量。活力单位定义为1 mg组织蛋白1 s分解1 μmol的过氧化氢的量为1个酶活力单位（U）。

3.7 比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）

GSH-Px的活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位时间内GSH减少的量来表示，GSH和5，5’-二硫对硝基苯甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423 nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可算出GSH减少的量，由于GSH能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。规定每1 mg蛋白质，1 min扣除非酶反应的作用，使反应体系GSH浓度降低1 μmol/L为1个酶活力单位。

3.8 硫代巴比妥酸（TBA）法测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量

在较高温度及酸性环境中，MDA可与TBA反应，形成红色的MDA-TBA加合物，通过比色法可对动植物组织或细胞裂解液中MDA进行定量检测。计算公式如下：

组织中MDA含量（nmol/mg prot）=（管吸光度-测定空白管吸光度）/（标准管吸光度-标准空白管吸光）×标准品浓度×样本测试前稀释倍数

4 前景展望

中国是一个水生生物资源十分丰富的国家，然而近年来由于鱼类栖息环境的变化、过度捕捞、不合理引种、外来生物等因素影响[37]，我国鱼类生物多样性处于衰退形势。虽然在鱼卵细胞的玻璃化冻存的研究中，还存在诸多的困难有待解决，但其在防止鱼类近亲、保存鱼类种质资源、维持生物遗传多样性等方面具有重要的应用价值[7]，随着我国科技的不断发展，相关研究的不断深入，不断优化鱼卵细胞玻璃化冻存途径和技术路线，解决鱼卵细胞自身存在的问题，降低各因子的影响作用，成功使用玻璃化方法冻存鱼卵细胞指日可待。

5 参考文献

[1] LI A P.Overview. hepatocytes and cryopreservation a personal historical perspective[J].Chemico-Biological Interactions，1999，121（1）：1-5.

[2] WHITTINGHAM D G.Survival of mouse embryos after freezing and thawing[J].Nature，1971，233：125-126.

[3] WHITTINGHAM D G，LEIBO S P，MAZUR P.Survival of mouse embryos frozen to -196 ℃ and -296 ℃[J].Science，1972，178：411-414.

[4] WILMUT I.The effect of cooling rate，warming rate，cryoprotective agent and stage of development of survival of mouse embryos during freezing and thawing[J].Life Sciences，1972，11：1071-1079.

[5] CHU Chao，HOU Li-min，LIU Ming-hui.Research Progress of Profound Hypothermia [J].Progress in Modern Biomedicine，2012，12（19）：3766.

[6] 李广武，郑从义，唐兵，等.低温生物学[M].长沙：湖南科学技术出版社，1997：69-71，101-105.

[7] 陈松林.鱼类配子和胚胎冷冻保存研究进展及前景展望[J].水产学报，2002，26（2）：161-168.

[8] 包华琼，李跃民，王新庄，等.3种因素对牛卵母细胞玻璃毛细管玻璃化冷冻效果的影响研究[J].动物医学进展，2004，25（6）：90-93.

[9] RALL W F，FAHY G M.Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196℃ by vitrification[J].Nature，1985，313：573-575.

[10] 杨琼霞，张绍志，俞雅芳，等.动物组织细胞玻璃化冻存方法的研究进展[J].科技通报，2007，23（2）：202-206.

[11] 李喜龙，季维智.动物种质细胞的超低温冷冻保存[J].动物学研究，2000，21（5）：407-411.

[12] NIEMANN H.Cryopreservation of ova and embryos from livestock：Current status and research needs[J].Theriogenology，1991，37：59.

[13] ARAV A，SHEHU D，MATTIOLI M.Osmotic and cytotoxic study of vitr-ification of immature bovine oocytes[J].Reprod Fertil，1993，99：353.

[14] OTOL T，YAMAMOTO K，KOYAMA N，et al.Cryopreservation of mature bovine oocytes following centrifugation treatment[J].Cryobiology，1997，34：36.

[15] CARROLL J，WHITTINGHAM D G，WOOD M J，et al.Extra 2 ovarian production of mature viable mouse oocytes from frozen primary follicles[J].J Reprod Fertil，1990，90：321.

[16] SELMAN K，WALLACE R A，SARKA A，et al.Stages of oocyte develo-pment in the zebrafish，Brachydanio rerio[J].Journal of Morphology，1993，218：203-224.

[17] ZHANG T，ISAYEVA A，ADAMS S L，et al.Studies on membrane perm-eability of zebrafish（Danio rerio）oocytes in the presence of different cryoprotectants.[J].Cryobiology，2005，50：285-293.

[18] EL-DANASOURI I，SELMAN H.Successful pregnancies and deliveries after a simple vitrification protocol for day 3 human embryos.[J].Cryobiology，2005，49：114-122.

[19] LUBZENS E，PEKARSKY I，BLAIS I，et al.Cryopreservation of oocytes from a marine fish：achievements and obstacles[R].Minneapolis，Minne-sota，USA，2005.

[20] WALLACE R A，SELMAN K.Cellular and dynamic aspects of oocyte growth in teleosts[J].American Zoology，1981，21：325-343.

[21] GUAN M，RAWSON D M，ZHANG T.Cryopreservation of Zebrafish（Danio Rerio）Oocytes by Vitrification.CryoLetters，2010，31（3）：230.

[22] 陈松林，刘宪亭.鱼卵和胚胎冷冻保存研究进展[J].淡水渔业，1991（1）：44-46.

[23] PU Chun-xia.Research progress on aquaporin[J].Journal of Chengdu University（Natural Science Edition），2010，28（2）：104-106.

[24] DELGADO M，VALDEZ JR，HARA T，et al.Expression of aquaporin-3 improves the permeability to water and cryoprotectants of immature oocytes in the medaka（Oryziaslatipes）[J].Cryobiology，2006，53（2）：160-168.

[25] LIU X-H，ZHANG T，RAWSON D M.Effect of cooling rate and partial removal of yolk on the chilling injury in zebrafish（Daio rerio）embryos [J].Theriogenology，2001，55（8）：1719-1731.

[26] JANIK M，KLEINHANS F W，HAGEDORN M.Overcoming a permeability barrier by microinjecting cryoprotectants into zebrafish embryos（Brach-ydanio rerio）[J].Cryobiology，2000，41：25-34.

[27] BEIR？O J，ROBLES V，HERR？EZ M P，et al.Cryoprotectant microinj-ection toxicity and chilling sensitivity in gilthead seabream（Sparus aurata）embryo[J].Aquaculture，2006，261：897-903.

[28] KOHLI V，ROBLES V，CANCELA M L，et al.An alternative method for deliveringexogenous material into developing zebrafish embryos[J].Biotechnology and Bioengineering，2007，98（6）：1230-1241.

[29] BART A N，KYAW H A.Survival of zebrafish，（Brachydanio rerio）embryo after immersion in methanol and exposure to ultrasound with implications to cryopreservation[J].Aquaculture Research，2003，34：609-615.

[30] SILAKES S，AMRIT N.Bart.Ultrasound enhanced permeation of metha-nol into zebrafish，Danio rerio，embryos[J].Aquaculture，2010，303（1-4）：71-76.

[31] LIU X H，ZHANG T，RAWSON D M.Feasibility of vitrification of zebrafish（Danio rerio）embryos using methanol[J].Cryoletters，1998，19：309-318.

[32] WU Peng-fei，DING Hao，TIAN Yong-sheng，et al.Study on toxicity and chilling sensitivity of Flounder Paralichthys Olivaceus embryos microin-jected cryoprotectants[J].Chinese Agricultural Science Bulletin，2009， 25（16）：301-308.

[33] ZHANG X S，ZHAO L，HUA T C，et al.A study on the cryopreservation of common carp Cyprinus carpio embryos[J].Cryo Letters，1989，10：271-278.

[34] ZHANG K J，LOU Y D，ZHANG Y J，et al.Studies on cryopreservation of three freshwater fishes embryos[J].J Fish China，1997，21：366-372.

[35] HARVEY B.Cooling of embryonic cells，isolated blastoderms and intact embryos of the zebrafish to -196℃[J].Cryobiology，1983，20（4）：440-447.

[36] 胡军祥，应华波，周国英，等.微波复温对玻璃化大鼠胚胎脑细胞活性的影响[J].浙江大学学报，2005（2）：75-79.

[37] 康超，雒敏义.浅析中国淡水濒危鱼类濒危原因及保护措施[J].中国水产，2010（12）：28-30.