川芎嗪对急性脊髓损伤大鼠神经细胞早期凋亡

摘 要：目的：观察川芎嗪对大鼠急性脊髓损伤后神经细胞的早期凋亡及其对Caspase-3mRNA表达的影响，进一步认识Caspase-3在脊髓损伤后细胞凋亡中的作用机制。方法：采用改良Allen's重物打击法建立大鼠急性脊髓损伤模型，120只成年SD大鼠，随机分成4组：正常组、模型组、甲强龙及川芎嗪组，每组各30只，造模后模型组、甲强龙组和川芎嗪组分别按时注射同体积的生理盐水，甲强龙及川芎嗪注射液。损伤后各时间采用BBB法行神经功能评分，流式细胞术观察细胞凋亡情况，透射电镜观察细胞形态学变化，并应用RT-PCR技术检测Caspase-3mRNA表达的情况。结果：模型组伤后6h出现了神经细胞的早期凋亡，至伤后24h达到高峰，伤后48h比24h略有下降，但仍持续在较高的水平，差异无统计学意义（P＞0.05）；川芎嗪治疗组伤后各时间点细胞凋亡与甲强龙组伤后各时间点细胞凋亡比较差异无统计学意义（P＞0.05），但川芎嗪组和甲强龙组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。伤后各时间点Caspase-3mRNA表达的趋势相近，都具有“量——时间”的依赖关系，川芎嗪治疗组与甲强龙组伤后各时间点Caspase-3mRNA比较差异无统计学意义（P＞0.05），但川芎嗪组和甲强龙组分别与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：本研究发现大鼠SCI后神经细胞6h内的即出现早期凋亡，比电子显微镜下判断凋亡出现的时间要明显提早；SCI后，损伤区脊髓组织Caspase-3mRNA水平明显升高，与细胞凋亡的比例和细胞超微结构的变化具有明显的相关性；早期使用川芎嗪能减轻大鼠急性脊髓损伤后的神经细胞凋亡，对大鼠急性脊髓损伤有一定神经保护作用，主要机制可能和抑制细胞凋亡的“级联反应”有关。

关键词：脊髓损伤；大鼠；川芎嗪；细胞凋亡；Caspase-3；基因

中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717(2011)12-2662-07

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收稿日期：2011-07-19

基金项目：浙江省中医药管理局基金资助项目（2010ZB017）

作者简介：王健（1974-），男，吉林人，副主任医师，博士研究生，研究方向：脊柱外科。

Effects of Tetramethylpyrazine on Expression of Early Apoptosis and

Caspase-3 Gene in Rats With Spinal Cord Injury

WANG Jian1， JIA Yuzhu2，ZHENG Chunwei3，XU Weixing4，LIU Jian4

(1.Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310053,Zhejiang, China;

2. Image Department, Zhejiang Tongde Hospital, Hangzhou 310012，Zhejiang, China;

3. Lab animal center, Zhejiang Tongde Hospital, Hangzhou 310012，Zhejiang, China;

4. Orthopaedics Department, Zhejiang Tongde Hospital, Hangzhou 310012，Zhejiang, China)

Abstract:Objective: Creating acute spinal cord injury (SCI) model in rats with modified Allen's method, to observe morphology of nerve cells in early apoptosis and study caspase-3mRNA expression in rats with tetramethylpyrazine(TMP) after spinal cord injury, in order to further understand mechanism of action of Caspase-3 in apoptosis after SCI and to explain mechanism of TMP in inhibiting apoptosis at the gene level. Methods:120SD rats were randomly divided into 4 groups: normal group, model control group,MP treatment group and the TMP treated group, 30 rats in each group. By modified Allen's method of making weight spinal cord injury model was established, after the SCI model was made, MP and TMP group were injected the same volume of saline on time. Neurological scores (BBB method) were recorded at different time points after injury. Apoptosis and morphological changes were observed by flow cytometry case and by transmission electron microscopy. While Caspase-3mRNA expression were detected by RT-PCR at different time points after injury. Results:Apoptosis rates of nerve cells of model group appeared in early apoptosis in 6h, Apoptosis rates compared 48h with 24h , decreased slightly, but still sustained at a high level, the difference was not statistically significant (P>0.05).The difference of apoptosis rates between TMP and MP treatment group at each time point was not statistically significant (P>0.05), but compared with model group, the difference was statistically significant (P0.05), but the difference compared the TMP group and the MP group with the model group were significant (P

Key words:Spinal Cord Injury; Rat; TMP; Apoptosis; Caspase-3; Gene expression

脊髓损伤(Spinal Cord Injury，SCI)是一种严重的神经系统损伤，致残率高，是导致功能残疾的主要原因，给家庭和社会造成沉重的负担。如何采取有效措施保护损伤的脊髓脊髓损伤的治疗一直是困扰患者和医学界的难题。

本研究在国内外相关研究和前期研究的基础上，采用改良Allen's重物打击法建立大鼠急性脊髓损伤模型，采用流式细胞术和透射电镜对大鼠SCI后神经细胞早期凋亡进行观察，进一步认识Caspase-3在脊髓损伤后细胞凋亡中的作用机制，观察川芎嗪对大鼠急性脊髓损伤后神经细胞的早期凋亡与Caspase-3mRNA表达的影响，对中药治疗治疗脊髓损伤的可行性进行初步探索，为进一步的基础研究和临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康、成年、清洁级Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)120只，重量(200±20)g，购自浙江省中医药研究院动物实验研究中心，雌雄不限，自然光照周期，进食、饮水不限。

1.2 实验药品 甲基强的松龙注射液（美国辉瑞制药公司，进口药品注册证号：H20070174）；注射用盐酸川芎嗪注射液（哈尔滨三联药业有限公司生产，国药准字H20041171）；0.9%氯化钠注射液（浙江天瑞药业有限公司生产，国药准字H33022242）。

1.3 主要实验器材及设备 752型紫外光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)，美国Biorad伯乐梯度PCR仪，型号：Mycycler；美国Biorad伯乐双通道实时定量PCR 仪（型号：DNA Engine Opticon2）；3300 Pro UV/VIS型紫外可见分光光度仪（瑞典Amerso Biosciences公司）；紫外投射仪（北京六一仪器厂）；水平式电泳装置（北京六一仪器厂）；Epics Altra流式细胞仪 （美国Beckman Coulter公司），Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，HITACHI-7650TEM透射电镜，LEICA EM UC7超薄切片机（德国），Hitachi S-3000N SEM扫描电镜（日本HITACHI公司）等。

1.4 动物造模及给药 取健康SD大鼠120只，雌雄不限，体重(200±20)g，称重后随机分组、编号，共4组：正常组（A组），模型对造组（B组），甲基强的松龙组（C组），川芎嗪组（D组），每组各30只。采用改良Allen's方法制作脊髓重物打击损伤模型。将B、C、D大鼠分别称重后，1%戊巴比妥钠以40mg/kg体重行腹腔内麻醉，消毒后以T10棘突为中心取背部后正中纵行切口，显露T9～L1棘突及椎板咬除后暴露硬脊膜。以T10脊髓段为中心暴露待损伤脊髓长约15mm。将长10mm，宽2 mm，厚1 mm的塑料垫片按大鼠脊髓背侧生理曲度屈曲预弯后，小心放置于T10处脊髓硬脊膜外，将特制的套筒嘴垂直轻放于塑料垫片正中心上，根据Allen’s重锤下坠打击法原理，用自制的重锤在注射器导管的引导下行重力打击，以50gcf(冲击量为5g重物从10cm高度自由落下，gram cm force)致伤能量强度的重力打击脊髓。撞击成功标准为：损伤处脊髓外观出血、水肿，观察到鼠尾痉挛性摆动，双下肢及躯体回缩扑动，造成大鼠脊髓中度损伤，即不完全性截瘫。冲洗伤口，用1/0号丝线缝合伤口，无菌敷料覆盖。空白组只进行椎板切除，不行重物打击造成脊髓损伤，即行切口关闭缝合。动物室温饲养，不限饮水及进食，截瘫动物膀肤区人工膀胱按压排尿，每天3次，防止并发症，直至形成反射性膀胱。观察记录大鼠双下肢的肌张力、反射，大小便及一般状态。

造模成功后半小时，甲强龙组腹腔内注射MP注射液(30mg/kg)，45min后再次注射（按5.4mg·kg-1·23h-1剂量）。后每日给药二次（按5.4mg·kg-1·h-1量，分两次注射）；川芎嗪组腹腔内注射与甲强龙组相同容积的川芎嗪注射液（200mg/kg）。45min后再次注射（按200mg/kg剂量），后每日给药二次（按200mg/kg）；模型组腹腔内注射相同容积的生理盐水，45min后再次注射，后每日给药2次。正常组正常喂养，不予任何处理。

1.5 大鼠SCI后后肢运动神经功能观测 采用BBB评分法\[1\]，将实验大鼠置于平坦不滑，光线充足的桌面上观察后肢各关节的活动状况，每次持续4min，并对其进行功能评分。分为3个部分:①评价大鼠下肢各关节活动(0～7分)；②评价大鼠下肢步态及协调功能(8～13分)；③评价大鼠下肢运动中爪的精细动作(14～21)，满分为21分。分别于伤后0.5h、5h、23h、47h由对该评分标准十分熟悉的非本组实验人员进行测定。

1.6 标本取材及流式细胞仪检测，透射电镜观察及Caspase-3mRNA检测 按观测时间点不同，分别在在相应时间点（伤后6h、24h、48h）麻醉动物，经左心室左升主动脉插管灌注肝素化生理盐水，剪开右心耳，行心脏灌注约200 mL至流出澄清液，换用4%多聚甲醛缓冲液约100mL心脏灌注固定30min，在腰椎用咬骨钳咬开椎管，小心分离取出胸腰段脊髓，取损伤段15mm左右长度脊髓，剥去表面脊膜和血管，在脊髓损伤中央区及上、下区域用锋利的刀片切各取1mm3脊髓组织，立即投入2.5%的戊二醛溶液中固定液中，4℃固定过夜（备电镜观察用）。剩余标本立即放入4℃PBS液中，将组织用细胞悬液制备仪制成匀浆，在300目尼龙网上过滤，用PBS洗细胞两次，调整细胞浓度为1×106/mL。留取0.5 mL细胞匀浆，0℃保温盒保存，当天送流式细胞仪检测；另外留取100-200μL，-70℃冰箱保存（备RT-PCR检测Caspase-3mRNA用）。

1.7 统计学分析 所有结果均以±s表示，RT-PCR结果利用2-C（t）法做相对定量分析。采用SPSS 13.0统计软件包，组间差异应用两组均数的t检验。以P值表示统计学的差异，P

2 结 果

2.1 造模后后肢运动神经功能评价 正常组及模型组伤后48h内各时间点BBB评分见表1。正常组在0.5h、5h、23h及47h各个时间点的BBB评分无明显变化，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；在造模后48h内，模型组在各个时间点BBB评分略较正常组明显下降，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；但模型组与正常组各个时间点评分比较，差异有统计学意义(P

2.2 药物干预治疗后细胞凋亡情况见表2。 模型组伤后6h出现了神经细胞的早期凋亡（图1a-d），至伤后24h达到高峰，伤后48h比24h略有下降，但仍持续在较高的水平，两者比较差异无统计学意义（P＞005）；与甲强龙组伤后各时间点细胞凋亡（图2a-c）川芎嗪组伤后各时间点细胞凋亡（图3a-c）比较差异无统计学意义（P＞0.05），但川芎嗪组和甲强龙组分别与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.0

图7a RT-PCR检测甲强龙治疗SCI大鼠后各个

时间点（6h、24h、48h）Caspase-3mRNA表达

图7b RT-PCR检测川芎嗪治疗SCI大鼠各个

时间点（6h、24h、48h）Caspase-3mRNA表达3 讨 论

SCI是人类致残率较高的疾病之一，SCI除了损伤本身的原发性损害之外，主要还由于炎症反应导致局部微循环的改变及缺血再灌注损伤、氧自由基释放、一氧化氮的神经

图8a 药物干预治疗SCI大鼠后各个时间点

Caspase-3mRNA表达趋势图

图8b RT-PCR技术检测川芎嗪对SCI大鼠

Caspase-8mRNA表达的影响毒性作用及细胞凋亡等所引起的继发性损伤\[2-3\]，导致功能尚失的主要原因是脊髓继发性损伤引起的残存神经细胞的凋亡\[4\]，从而加重神经损害，进一步影响神经功能的康复。SCI后少突胶质细胞是最容易受到微循环变化影响的一类细胞，是最常见的细胞凋亡的类型，及时阻断凋亡过程中最重要的凋亡启动和效应因子的Caspase蛋白酶系列的“级联反应”，保护残存的神经元，对脊髓继发性损伤的治疗意义重大\[5-6\]。

3.1 脊髓损伤后神经细胞凋亡的触发机制 脊髓损伤后神经细胞凋亡机制根据触发信号大体上可分为受体依赖型和非受体依赖型。受体依赖型凋亡也称为外源性凋亡，肿瘤坏死因子和诱导型一氧化氮是两种主要的外源性促凋亡信号，它们分别与相应的受体结合而产生触发凋亡的效应，肿瘤坏死因子与神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞的Fas受体结合，使细胞内Caspase-8的激活，触发凋亡系列酶激活，使凋亡效应酶Caspase-3和Caspase-6激活，而分解DNA分子成为150～300bps大小的大量的小片段，解体细胞结构蛋白，最终细胞凋亡\[6\]。巨噬细胞能产生诱导型一氧化氮酶而合成一氧化氮，使其破坏细胞内的线粒体，释放出细胞色素C，激活Caspase-8，诱导Caspase-3、Caspase-6激活，最终也使细胞凋亡\[8\]。非受体依赖型细胞凋亡也称为内源性凋亡，比如大量兴奋性递质谷氨酸激动神经细胞引起的凋亡，它通过提高细胞内的钙离子浓度，直接激活Caspase-3或破坏线粒体释放细胞色素C，产生凋亡激活因子而激活Caspase-9，最终使得Caspase-3、Caspasc-6激活而细胞凋亡。

细胞凋亡发生和发展概括为3个阶段:信号传递阶段、中央调控阶段、结构改变阶段\[9\]。细胞凋亡从内外多因子复杂的相互作用诱导产生凋亡信号，传递至半胱-天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)并使其活化开始，以蛋白底物裂解、细胞解体为结局,从而使细胞凋亡得以完成。

Caspase也称ICE样蛋白酶被认为是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶，可作为凋亡的重要启动子和效应子在细胞的凋亡中发挥作用。Caspase可截断凋亡细胞与周围细胞的联系，破坏重组细胞骨架，阻止DNA复制和修复，干扰DNA、RNA的拼接，破坏细胞核结构，诱导凋亡细胞出现吞噬信号，使细胞成分讲解并形成凋亡小体。Caspase-3是凋亡过程中重要的蛋白酶，是多种凋亡途径的共同下游效应部分，在外伤性脊髓损伤动物模型中Caspase-3活性显著增强，其中脊髓损伤神经元和胶质细胞凋亡与Caspase-3激活有关, 而且脊髓损伤后Caspase-3 的表达与神经细胞凋亡水平呈正相关\[10\]。

本实验研究发现：在脊髓损伤的早期由于机械性打击，神经细胞主要以坏死为主，模型组在损伤后6h开始出现大量的神经细胞的早期凋亡。Caspase-3在伤后6h开始表达，至伤后24h达到高峰，至伤后48h仍持续较高的峰值，与伤后24h比较无统计学意义（P＞0.05），而MP和TMP治疗组Caspase-3mRNA表达的趋势与模型组相似，具有一定“时间——量”的相关性，并且脊髓损伤后Caspase-3 的表达与神经细胞凋亡水平呈正相关。由此可以验证作为Caspase细胞凋亡“级联反应”下游的Caspase-3分子激活后，才完成细胞凋亡。大鼠脊髓损损后存在细胞凋亡现象发生，从损伤后6h开始，持续2周以上，可见脊髓损伤的治疗时窗较长\[11\]。但从细胞凋亡出现的高峰时间来看，在损伤6h至损伤后48h是防止脊髓继发性损伤细胞凋亡的黄金时期，从脊髓损伤后到Caspase-3活化这段时间应该是脊髓损伤干预细胞凋亡、减轻继发性脊髓损伤治疗的最佳治疗窗。本实验再次证实Caspase-3参与了脊髓损伤细胞凋亡的启动和调节，这就为以后应用Caspase-3阻滞剂和基因治疗脊髓损伤提供了理论依据。

3.2 甲强龙对细胞凋亡的影响 甲基强的松龙(methylprednisolone,MP)是糖皮质激素的典型代表药物，是近年来治疗急性脊髓损伤研究最为集中的一种合成中效糖皮质激素，为美国FDA最早批准的治疗急性脊髓损伤的临床有效药物，迄今为止应用最为广泛的治疗脊髓损伤的药物，疗效较为肯定,其作用机制至今仍未完全了解。实验研究证明，MP可对抗继发炎症反应，通过抑制主要炎性转录因子活化表达减少其转录炎性产物的生成，以及减少肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(L)-1β、L-α等生成，从而对抗脊髓损伤炎症反应，保护脊髓组织\[11\]。并能提高神经兴奋性与传导性，抑制脂质过氧化，改善脊髓血流量，维持细胞膜、血管壁细胞膜的完整，限制细胞外钙离子变化，抑制脊髓损伤后神经细胞凋亡。MP还可以抑制急性脊髓损伤后c-fos表达，促进热休克蛋白(HSP)70表达，可以逆转钙离子在急性脊髓损伤后的不平衡分布，提高钠-钾泵(Na+-K+-ATPase)活性，抑制脂质过氧化反应，使其免遭自由基攻击；还能够抑制磷脂酶A2的活性，促进前列腺素的合成，增加损伤脊髓血流量，并促进脊髓组织修复和再生，减轻组织渗出和水肿\[12\]； MP对于急性脊髓损伤大鼠脊髓中Nogo-A的表达有一定的抑制作用，并且MP能够明显提高bcl-2蛋白的表达，明显降低bax蛋白表达，且二者均与MP降低凋亡细胞比例的时间完全一致，说明MP可以通过提高bcl-2/bax蛋白的阳性表达的比例来抑制神经细胞的凋亡\[13-14\]。目前，基于NASCI(美国全国急性脊髓损伤研究)第2、3次临随机对照研究结果，大多数学者认为甲基强的松龙(Methylprednisolone,MP)是急性脊髓损伤的“标准治疗”\[15\]。MP通过抑制炎症反应、减轻组织水肿、抑制血管活性，增加脊髓血流量等途径阻止继发性损伤的发生和发展。

本实验研究发现甲强龙SCI大鼠治疗后各个时间点细胞凋亡比例较模型组明显下降，而且细胞超微结构比模型组亦有一定的改善，并且在应用甲强龙后各时间点Caspase-3mRNA的表达量比模型组有所下降（P＜0.05），各组治疗后Caspase-3mRNA表达呈现相同趋势，这与甲强龙治疗急性脊髓损伤的国际“标准治疗”方案的应用时限是相符合的\[15\]；但甲强龙并不能推迟细胞凋亡出现的高峰时间，提示甲强龙对脊髓损伤后的大鼠脊髓组织内的神经细胞的凋亡具有一定的抑制作用，MP抑制细胞凋亡的途径可能与非特异性抑制Caspase-3mRNA的表达有关。

3.3 川芎嗪对细胞凋亡的影响 川芎嗪是从传统活血化瘀中药川芎中分离提纯出来的一种生物碱单体，其化学结构为四甲基吡嗪(Tetramethylpyrazine, TMP)，C8H12N2，分子量136，是现在研究得较多的中药单体之一。除了川芎之外，麻黄中也含有川芎嗪\[16\]。它已经较普遍地应用于治疗心脑缺血性疾病，呼吸系统疾病、肾脏疾病和肝硬化等疾病，改善微循环，疗效确切，副反应少\[17-19\]。大量的实验及临床研究表明，川芎嗪药理效应能在细胞凋亡的途径的多个靶点上产生抗细胞凋亡的作用，从而减轻或防治脊髓的继发性损伤。川芎嗪是一种典型的钙离子通道阻断剂\[20\]，具有抑制自由基的产生、提高内源性SOD活性、清除氧自由基\[21\]、改善血液流变学\[22\]、抑制血小板聚集、抑制脂质过氧化、抑制兴奋性氨基酸的毒性作用等药理特点，能减轻脊髓水肿与离子代谢障碍\[23\]，改善脊髓血流，对脊髓损伤具有一定的保护作用。川芎嗪有抑制血小板激活、聚集，扩张小动脉，改善微循环，钙拮抗剂以及清除氧自由基等作用。

本实验研究发现：川芎嗪SCI大鼠治疗后各个时间点细胞凋亡比例较模型组明显下降，而且细胞超微结构比模型组亦有一定的改善，并且在应用川芎嗪后各时间点Caspase-3mRNA的表达量比模型组有所下降，在治疗后Caspase-3mRNA表达呈现下降的趋势同甲强龙组接近，与甲强龙组伤后各时间点比较细胞凋亡比例略高，但差异比较无统计学意义（P＞0.05），细胞超微结构比较变化不大，提示川芎嗪对脊髓损伤后的大鼠脊髓组织内的神经细胞的凋亡也具有一定的类似甲强龙的抑制作用，但从川芎嗪抑制Caspase-3mRNA的趋势的来分析，川芎嗪同样也不能推迟细胞凋亡出现的高峰时间，推断川芎嗪抑制细胞凋亡的途径可能与抑制Caspase-3mRNA的表达有关。

毕竟脊髓损伤后继发性损伤的细胞凋亡参与的凋亡基因很多且机制复杂，其信号传递通路尚未完全研究清楚，某一个或几个基因都不可能在如此复杂的过程中起到根本性的作用；也不可能从一个实验就可以明确某种药物对细胞凋亡的抑制作用，有关川芎嗪的对细胞凋亡的多重作用机制需进一步深入研究。

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