霍乱弧菌分子生物学检测技术的应用

【摘要】 现今，随着分子生物学的快速发展，许多先进的分子生物学技术都被应用于对霍乱弧菌的研究，不仅为霍乱弧菌的检测以及快速分型提供了十分重要的依据，还从分子水平上阐明了霍乱疫情的形成，流行性质，菌株类型，以及霍乱弧菌的变异和遗传情况。

【关键词】 分子生物学；相关检查技术；霍乱弧菌

霍乱是由霍乱弧菌感染引发的一种流行广泛的甲类传染病[1]。霍乱弧菌是肠道传染病霍乱的病原体[2]。人类是霍乱弧菌的唯一易感者[3]。被感染者，往往表现为腹泻、剧烈呕吐、脱水、甚至死亡。从1817年至今，人类累计经历了7次大规模流行的霍乱。霍乱，它具有起病急骤、传播迅速、波及广泛、病死率高等特点，霍乱弧菌广泛的分布自然界中，可以通过污染水源及食物而引发疾病。对于霍乱的预防及治疗的关键在于，及时监测疫区外环境标本。对霍乱弧菌做出迅速、准确的检测是霍乱防治的重要方法。传统的分离培养方法费时费力，不能适应疾病的快速发展，将分子生物学的相关检测技术应用于对霍乱弧菌的检测，可精准、快速的进行检测，为疫情的处理，临床诊断提供了及时可靠的依据，同时也可有效追踪传染源，确定霍乱菌株类型，预测霍乱的流行趋势。本文将对几种用于霍乱弧菌分子生物学检测技术，作简单的介绍。

1 PCR

PCR技术主要包括：普通PCR、荧光PCR、套式PCR、多重PCR等。

1.1 普通PCR 普通PCR是通过检测出霍乱弧菌0139和01菌群的ctxA、ctxB基因，继而检测属于霍乱弧菌并检测出其毒力基因的常规方法。Shirai[4]依据LT和CT的高度同源性，建立了基于ctx基因的特异的PCR检测方法，它检测细菌染色体的灵敏度很高，能检出仅含三个活菌的样本。

1.2 荧光PCR 荧光定量PCR，它是通过荧光或者荧光燃料标记的特异探针，对PCR的产物进行跟踪标记。它具有无需电泳、快速定量、无交叉污染等诸多优点，被广泛的应用于临床。应用荧光PCR可快速有效的检测出霍乱弧菌0139群、01群、非0139群、非01群毒素的相关基因。

1.3 套式PCR 套式PCR，也可称为巢式PCR，即使用两对PRC引物来扩增完整的片段。套式PCR中，第一对引物扩增片段的方式与普通PCR极为相似，第二对引物也叫做巢式引物，他们往往结合在第一次PCR产物的内部，这就导致第二次PCR扩增的片段会短于第一次。巢式PCR，它具有非常高的特异性。Susanna等依据0139群O抗原合成相关基因片段建立的套式PCR可用于0139群霍乱弧菌的特异检测[5]。

1.4 多重PCR 多重PCR，也可称为复合PCR或者多重引物PCR，它是在同一个PCR反应体系中加入两对及以上的引物，在同一时段，扩增出许多的核酸片段，它具有高效性、系统性、经济便捷性等诸多优点。

2 AFLP

AFLP（扩增片段长度多态性）是一项新型的分子标记技术，是由荷兰的Pieter Vos 等在1993年发展起来的一种多态性DNA检测新方法，它具分析需要DNA含量少，可重复性好，多态性强，分辨率高，无放射线损害，适用性广，稳定性好等诸多优点。AFLP技术的原理：对基因组酶切后的片段，进行选择性扩增，已获取的扩增片段经电泳检测，继而检测出获得的不同长度的扩增片段。Jiang[6]采用AFLP技术分析不同环境，不同地点的临床分离的霍乱弧菌多态性，结果显示分离的临床0139菌株及01菌株在遗传学关系上要比环境中的0139菌株及01菌株更为紧密。AFLP分析与PFGE、RFLP、RAPD、Rep-PCR等适应范围相似，并兼备以上各种方法的优点，且分辨率极高，稳定性强，可为临床工作提供丰富信息。

3 PFGE

PFGE（脉冲场凝胶电泳）是一种常用的分离大分子核酸的方法。用脉冲场凝胶电泳对霍乱弧菌进行分型，其分辨力更高，可为霍乱弧菌分离株间进行同源性分析、遗传相关性分析、追踪传染源、预测疫情变化、防治措施的制定提供可靠依据。脉冲场凝胶电泳分辨力高，重复性好，即使在不同实验室，所得结果仍具可比性。

4 MLST和MLEE

MLEE（多位点酶电泳法），它以一个基因一种酶学说为依据，通过监测酶电荷及分子量的变化情况，来推算对应位点的多态性，然后进行综合分析，从而获悉细菌的具体分型及遗传学特点。但是，不同实验室间结果不可进行比较。

MLST（多位点序列分析），是一种新型的细菌分型技术，它由MLEE改良而来，它比PFGE的分辨力更高。

5 MLVA

MLVA（多位点可变数目串联重复序列），是在PCR基础上发展起来的新型技术，具有高度多态性的特点。对DNA的纯度要求不高，特异性高，重复性好，可得到数字化的结果，可进行实验室间比对，且可在短时间内大量的处理样品。

6 讨 论

PCR技术具有特异性强、灵敏度高、检测快速、成本低廉等诸多优点，但是，在菌株遗传关系分析及菌株分型方面不如其他的分子生物学检测手段，所以，PCR技术在临床主要被应用于早期对菌株的筛查。AFLP技术是以PCR技术为基础的新型技术，它继承了PCR的优势，但更加的可靠，与PCR相比，它可同时检测出大量不同的核酸片段，一次扩增就能分析比较几十个甚至百个基因位点，且不需制备探针，不需预知基因的序列特点。但，AFLP技术价格昂贵，对DNA纯度，内切酶质量有很高的要求，模板反应往往迟钝，还可能发生缺失或错配的现象。与AFLP技术相比PFGE是一种操作简便、稳定性好、分辨力高的方法。PFGE已经被公认为多种细菌基因分型的标准，是目前较为成熟的基因分型方法。但，PFGE技术也具有一定的局限性，如耗时久，未形成国际同一标准，不利于实验室间比较等。PFGE技术与MLST相比，MLST建立有大型的国际化数据库，可以进行实验室间的比对，也可作为国际流行病研究的依据。但MLST技术费用高，工作量大，技术要求极为严格，设备昂贵，所以并不适用于暴发流行的常规检测。MLVA是以PCR为基础的新型分型方法，它对DNA的纯度要求不高，特异性高，重复性好，可得到数字化的结果，可进行实验室间比对，且可在短时间内大量的处理样品。

综上所述，各种分子生物学检测手法各有千秋，可以互相取长补短，我们可以根据检测的目的以及实验室的现有设备选取合适的方法，用于临床诊断及研究。

参考文献

[1] 巩西玲.两种霍乱弧菌检测技术的应用研究[J].适宜技能，2013，21（12）：134-134.

[2] 吴以华，徐景野，李岳良，等.微量培养板不同保存时间对霍乱弧菌培养效果的观察[J].中国卫生检验杂志，2007，27（4）：629-630.

[3] 熊长辉.霍乱弧菌分子生物学检测技术介绍[J].现代预防医学，2012，39（17）：4536-4537.

[4] Shirai H，NishibuchiM，Ramamurthy T，et al.Polymerase chain reaction for detection of the cholera enterotoxin operon of Vibracularia[J].J Clin Micro bio，1991，（29）：2517.

[5] Dugo M，Breggion G，Susanna F，et al.Acute renal failure in a patient with bilateral aneurysms of iliac common arteries[J].Ren Fail，1996，18（4）：689-6901.

[6] Jiang S C，Matte M，Matte G，et al.Genetic diversity of clinical and environmental isolates of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism fingerprinting[J].Appl Environ Micro biol，2000，66（1）：148-153.