电喷雾萃取电离质谱直接检测人体呼出气体中的乙腈

摘要人体呼出气体携带大量的生理病理信息，在临床诊断和代谢组学研究中发挥着日益重要的作用。本研究在未对样品进行预处理条件下，采用电喷雾萃取电离质谱（EEIM）技术直接测定呼出气体中乙腈分子。在优化的实验条件下，结合多级串联质谱，有效地获得了人体呼出气体中乙腈含量的信息。对气相乙腈的检出限为71pLL，线性范围为76～191pLL。以两名健康志愿者呼出气体为实例，实际检测了其中乙腈的含量分别为19和1pLL，相对标准偏差（R）分别为6%和72%。结果表明，本方法灵敏度高、精密度好、分析速度快、特异性强，能够承受呼出气体中复杂基体的影响，适合于呼出气体中痕量乙腈的直接半定量检测，也可为呼出气体中其它小分子物质的检测提供新思路。

关键词电喷雾萃取电离质谱；乙腈；呼出气体

1引言

近年来，呼出气体检测凭借其无损、快速、取样方便等优势，及其中的生物标记物分子与疾病（如肺癌、新陈代谢、脏器状况的相关性，逐渐成为现代临床医学、分析检测领域研究的热点。有研究表明，乙腈可作为吸烟的标志物，随着吸烟数量的增加，吸烟者呼出气体中乙腈的含量迅速升高，即使是被动吸烟者，其呼出的乙腈含量也明显高于正常对照组]。据报道，乙腈还与吸毒成瘾、膀胱癌等有一定关系。因此，建立一种实时在线、灵敏、快速、准确的呼出气体中乙腈的检测方法，对乙腈在人体中的代谢及其在人体生理病理中所产生的作用的研究具有重要意义。

乙腈分子检测的常规方法有气相色谱法（G）和气相色谱质谱法（GM）。但因灵敏度低，G及GM法很难对呼出气体中乙腈进行直接快速原位检测。选择离子流动管质谱法（electionflowtubemassspectrometryIM）和质子转移反应质谱法（ProtontransferreactionmassspectrometryPRM）已用于呼出气体中乙腈的检测。但IM法需对呼出气体进行收集和预处理，且灵敏度不高，难以实现乙腈的实时在线分析；而PRM法虽可进行呼吸气体在线分析，但由于乙腈分子较难质子化，对仪器的要求更高。加之，呼出气体基体成分复杂（含氮、氧、水、挥发性非挥发性有机化合物等），受环境的影响较大，检测结果的准确性受到了一定限制。EEIM是一种适合于复杂基体样品分析的新兴离子化技术，它能将中性样品和带电试剂离子分开，并在线完成样品的萃取和电离，适宜于对样品进行活体、直接、实时检测。本研究利用其具有可调三维空间、方便更换萃取试剂及保证人身安全等优点，以硝酸银为萃取溶剂，在无需样品预处理条件下直接对呼出气体中乙腈进行快速质谱定性及半定量分析。

2实验部分

21仪器与试剂

EEI离子源：东华理工大学研制。LQXL增强型线性离子阱质谱仪（美国innigan公司），配有Xcalibur数据系统。KQ2型超声清洗仪（昆山超声仪器有限公司）；精密电子天平（Mettleroledo公司）。甲醇（色谱纯，Khemicals公司）；AgNO（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；乙腈（色谱纯，ikmaechnologies公司），水为实验室自制超纯水。用水配制1mgL乙腈标准储备液。用甲醇配制1mgLAgNO溶液，作为喷雾萃取溶剂。呼出气体样品来自健康志愿者。

22实验方法

以超纯水梯度稀释乙腈标准储备液至，1，2，，1和2nLL各2mL，分别置于mL干净、干燥的锥形瓶中。用带有两支特氟龙通气管（内径2mm外径mm）的橡皮塞密封住盛有标准溶液的锥形瓶，其中一支通入乙腈溶液液面下2cm，该气管上端连接一个控制阀，以控制惰性气体（N2）的流速；另一支则位于液面上方，将液面上的空气（含乙腈分子）通过转子流量计引入EEI离子源，流速为8Lmin。乙腈分子与来自EEI另一通道的试剂Ag+碰撞，形成+离子，进入质谱被检测。

采用气液转换公式计算引入EEI离子源的乙腈浓度：

2实验条件

实验采用正离子检测模式，质量范围～a；雾化气（N2）压力为1MPa；质谱离子传输管温度为℃；喷雾电压为kV；

ollisioninduceddissociationI能量分别为1%和16%，碰撞持续时间分别为和6ms。其它实验参数由系统自动优化。需要注意的是，因实验采用1mgLAgNO甲醇溶液，为防止Ag+对仪器的污染和损伤，喷雾溶剂通道与水平面夹角为9°，溶剂喷雾口与质谱口距离为cm；为保证样品分子最大限度与试剂离子进行碰撞并发生反应，两喷雾通道夹角保持12°，样品喷雾口与质谱入口距离为cm，如图1所示；进行样品检测时，为防止呼出气体中待测物分子冷凝于样品通道管壁上，采用加热恒温装置，使样品传输管温度保持在8℃。

结果与讨论

1乙腈标准品的EEIM分析

一级谱图中还有丰度为%的mz166和168。选择mz166为母离子进行二级质谱分析，得到碎片离子mz18，为母离子丢失一个2O分子（图2c）；进一步以碎片离子mz18为母离子作三级质谱分析，得到离子mz17（图2c及插图），即母体继续丢失一个N分子。同样地，对mz168进行分析，确认其为19Ag+结合2O和N分子得到。

ig2EEIMnspectraofstandardacetonitrilesolution

aEEIM一级质谱图；bmz18及mz1的二级质谱图；cmz166的二级、三级（插图）质谱图；dmz189的二级、三级（插图）质谱图。

aEEIMspectrum；bM2spectraofmz18andmz1；cM2Minsetspectraofmz166；dM2Minsetspectraofmz189

2呼出气体的EEI质谱图

图呼出气体中乙腈的EEIMn质谱图

igEEIMnspectraofacetonitrileinhumanexhaledbreath

aEEIM一级质谱图；bmz18及mz1的二级质谱图；cmz19的二级质谱图；dmz17的二级、三级（插图）质谱图。

aEEIMspectrum；bM2spectraofmz18andmz1；cM2spectrumofmz19；dM2Minsetspectraofmz17

呼出气体中乙腈的半定量分析

目前，呼出气体定量分析的准确度主要受制于没有合适的呼出气体标准样品。本研究采用22节的实验方法，通过理论计算，将液相中乙腈浓度换算成气相中乙腈浓度，为气态样品的定量分析提供了一个有效的思路。虽然所使用的乙腈标准样品与呼吸气体真实样品不完全一致，但它仍可为呼出气体中乙腈检测提供有效的定量信息。图乙腈的校准曲线

igalibrationcurveofacetonitrilestandardsolution

1线性范围、检出限和精密度实验配制系列梯度浓度～2nLL的乙腈标准溶液，按上述方法进行实验。为排除假阳性信号，选择mz18（＼[17Ag+N＼]+）的二级特征碎片离子mz17（Ag+）进行定量分析，同时扣除相应的背景。每个浓度的标准样品测定7次，以其净响应信号强度平均值与对应的气相乙腈浓度绘制标准对数曲线（图）。实验表明，气相乙腈浓度在76～191pLL范围内，离子强度与浓度具有较好的线性关系。线性回归方程为logI=922logcg+6，相关系数R=999。

对nLL标准样品平行测定1次，精密度（R）为%，气相乙腈的检出限（LO，N=，根据LO=cσ进行计算）为71pLL。可见，本方法灵敏度高、检出限低、精密度好，适合于痕量乙腈的半定量检测。

2呼出气体中乙腈含量分析两名无吸烟习惯的健康志愿者，年龄分别为2和26岁。志愿者早晨（约8∶am）空腹状态下的呼出气体通过特氟龙管引入EEI源，呼出气体流量约为8Lmin，得到二级特征信号mz17的净响应信号强度。每名志愿者呼气1次，每次持续1～1s。通过校准曲线，由线性回归方程计算得呼出气体中乙腈含量。取1次测量平均值，所检测两名志愿者呼出气体中乙腈含量分别为19和1pLL，R为6%和72%。图午餐前后6名志愿者呼出气体中乙腈含量变化

igChangeofacetonitrileconcentrationinbreathbeforeandafterlunchforsixvolunteers实验表明，本方法分析速度快、特异性强、精密度好，适宜于人体呼出气体中痕量乙腈的检测。