基于聚吡咯修饰膨胀石墨电极的甲胎蛋白电化学免疫传感器

摘要：构建了测定人血清中甲胎蛋白AP的电化学免疫传感器。此免疫传感器的制备采用恒电位法在膨胀石墨EG电极表面合成聚吡咯PPy，再以戊二醛GA作为交联剂，固定辣根过氧化酶标记的AP抗体RPantiAP。此免疫传感器在含AP的溶液中于℃温育min后，再在传感器表面修饰普鲁士蓝P作为电子介体，抗原抗体免疫结合产生的免疫复合物会导致RP对P催化氧化的效率降低。在优化条件下，AP的浓度在1～μgL范围内呈线性关系，检出限为62pgmLN=。这种基于PPy修饰EG电极的免疫传感器制备简单，灵敏度高且价格低廉，有望成为一次性电化学免疫传感器。

关键词：甲胎蛋白；膨胀石墨；电化学免疫传感器；酶标抗体；普鲁士蓝

1引言

甲胎蛋白AP是一种胚胎发育早期的主要血清蛋白，成人由肝细胞产生，含量极微，血清中AP的升高对原发性肝癌诊断具有重要意义＼[1＼]。目前，放射免疫法RIA是公认的准确测定AP的方法，但存在放射性污染。近年来，各种采用非放射性标记的免疫技术相继建立，并得到迅速发展。免疫传感器是耦联含有抗原抗体分子的生物敏感膜与信号转换器的一种新型生物传感器，其测定原理基于抗原或半抗原和其特异性抗体结合形成稳定的抗原抗体复合物＼[2＼]。电化学免疫传感器由于具有很高的特异性和灵敏度而成为近年来的研究热点之一＼[＼]。然而，该类传感器常需要采用铂、金等贵金属或者玻碳作为电极材料，这些电极价格昂贵，限制了可抛弃型电化学免疫传感器的发展。因此，基于一次性传感表面的可抛弃型电化学免疫传感器的研究显得尤为重要。有关丝网印刷电极在电化学免疫传感器中的应用已有报道＼[＼]，这类电极的主要优点在于可批量生产、一次性使用、检测操作简单等。膨胀石墨EG作为一类新型炭材料具有良好的导电性和化学稳定性＼[6＼]且制备容易符合基底电极的要求[7]。

聚吡咯PPy是一类功能高分子，可用于制作直接电化学电极功能基质膜。聚合物包埋法是一种传统的抗体固定化方法＼[8＼]，然而包埋法可能会使抗体变性，失去活性。而且大部分的抗体包埋于聚合物基底中，不能与抗原有效结合＼[9＼]。本研究将PPy膜修饰到EG电极上，利用其活性基团亚氨基与交联剂戊二醛GA的一个醛基发生交联；GA上的另一个醛基用于结合辣根过氧化酶标记的AP抗体RPantiAP。然后在传感器表面修饰一层普鲁士蓝P，由于P具有较好的电化学活性，因而可用于电子介体。酶标抗体上的RP能催化P的电化学氧化，因此根据峰电流的大小变化，可确定待测样品中AP的含量，从而制备了AP免疫传感器。2实验部分

21仪器与试剂

JM66LA型扫描电子显微镜日本电子株式会社，I66型电化学工作站华科普天科技有限公司。AP酶联免疫试剂盒上海领潮生物科技有限公司。两份人血清样品由常州市第二人民医院提供。

22基于聚吡咯修饰膨胀石墨电极的AP免疫传感器的构建

根据文献＼[1＼]，将天然鳞片石墨氧化后制备EG。称取7gEG，用压片机压制成片状的EG电极。将面积为1×cm2的EG电极浸入到含1molL吡咯，2molLNal中作为工作电极，分别以铂片和饱和甘汞电极E作为对电极和参比电极，在工作电极上施加8V的电位使吡咯单体在EG电极表面发生聚合。聚合1s后，将EG电极取出，用去离子水洗净，在室温下干燥，即得到PPy膜修饰的EG电极。将该修饰电极浸入到2%GA溶液中活化h，得到膨胀石墨聚吡咯戊二醛EGPPyGA电极。将1μLRPantiAP滴加到电极表面，在℃下温育min，再用p7的P冲去松散结合的酶标抗体，晾干；在固定了酶标抗体的传感器表面滴加μL2μgLAP抗原标准溶液，用于考察该免疫传感器的最佳工作条件。

2普鲁士蓝的固定及免疫传感分析

三电极系统：以修饰了RPantiAP和AP抗原的EG电极为工作电极，铂电极为对电极，E为参比电极。电解质溶液含2molLl、2molLKl、mmolLKeN6和mmolLel溶液，恒电位V聚合s合成P，再将电极置于1molLl1molLKl溶液中，以mVs的扫速在

ymbolm@@ ～V之间循环伏安扫描至稳定即得到修饰了P的免疫传感器。