PPAR—γ在兔二次打击MODS模型中的表达

[摘要] 目的 探讨过氧化物酶增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator -activated receptor γ， PPAR-γ）在二次打击多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）中的表达。 方法 采用Wiggers′法造成兔失血性休克并给予液体复苏，6 h后腹腔注射脂多糖（LPS）引起MODS，24h后取肝脏组织，RT-PCR法半定量分析肝脏组织中PPAR-γ的表达。 结果 兔肝脏中PPAR-γ mRNA的表达，在创伤失血空白组及二次打击空白组中，其表达较假手术组明显下降（P < 0.05），但两组之间没有显著差异（P > 0.05）。在创伤失血组及二次打击组中，罗格列酮能上调PPAR-γ的表达（P < 0.05），GW9662能抑制PPAR-γ的表达（P < 0.05）。 结论 PPAR-γ在二次打击MODS模型中的表达是下降的，罗格列酮能上调其表达，GW9662能够阻断罗格列酮对PPAR-γ的上调。

[关键词] PPAR-γ；MODS；二次打击

[中图分类号] R459.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）03-0021-02

在外科中，由于创伤、感染、休克等因素影响，经常会出现多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），由于在诊断及治疗上的困难，导致其病死率极高，成为当今急危重症医学领域的重大挑战。过氧化物酶增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ）是一种依赖配体活化的转录因子，属于核激素受体超家族成员，基于其对炎症反应的调控作用，为MODS的研究提供了新的研究方向。在我课题组已有的研究中[1]，已经在脂多糖（LPS）诱导的MODS动物模型中证实其能够减轻炎症反应，而PPAR-γ在二次打击引起的MODS中的作用的相关研究尚少。本实验通过在失血性休克并内毒素诱发的二次打击兔MODS模型中监测PPAR-γ的表达，探讨其在双相迟发型MODS中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与实验动物及分组

脂多糖（LPS）、GW9662及二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司；罗格列酮（ROSI，商品名：文迪亚）购自葛兰素史克有限公司；RT-PCR试剂盒（Toyobo公司）。健康雄性日本大耳兔，体重（2000±100）g，购自于西安交通大学医学院动物实验中心。将56只兔随机分为7组，每组8只，分别为：①假手术组（sham空白组）：仅给予手术分离股动脉。创伤失血组（trauma-hemorrhage group，T-H组）：②创伤失血空白组，T-H空白组）仅予以失血性休克及液体复苏，之前30 min给予耳缘静脉注射10%DMSO 1 mL/kg；（2-1创伤失血-罗格列酮组，T-H-R组）予以失血性休克及液体复苏，之前30 min给予经耳缘静脉注射罗格列酮（溶于10%DMSO中）3.12 mg/kg；（2-2创伤失血-GW9662，T-H-G组），予以失血性休克及液体复苏，之前30 min经耳缘静脉注射罗格列酮（溶于10%DMSO中）3.12 mg/kg，15 min注射GW9662（溶于10%DMSO中）0.156 mg/kg。③二次打击组（double-hit group，D-H组）：（3-1，二次打击空白组，D-H空白组）仅予以失血性休克及液体复苏后LPS刺激，并给予耳缘静脉注射10%DMSO 1 mL/kg；（3-2，二次打击-罗格列酮组，D-H-R组）予以失血性休克液体复苏及LPS刺激，LPS刺激之前30 min给予经耳缘静脉注射罗格列酮（溶于10%DMSO中）3.12 mg/kg；（3-3，二次打击- GW9662，D-H -G组）予以失血性休克液体复苏及LPS刺激，LPS刺激之前30 min经耳缘静脉注射罗格列酮（溶于10%DMSO中）3.12 mg/kg，15 min注射GW9662（溶于10%DMSO中）0.156 mg/kg。

1.2 二次打击MODS模型的制备和取材

参照Wiggers′法造成低血容量性休克，以3%戊巴比妥钠（1mg/kg）耳缘静脉注射麻醉。麻醉成功后分离股动脉插管接三通，监测血压至正常15 min内快速放血（血液肝素化后室温保存），维持动脉压在6.0～7.3 kPa之间1 h时。休克终点快速回输失血和1倍失血量的林格液，时间不少于30 min，维持血压至稳定（如有必要注射血管活性药物）。6 h后，经腹腔注射LPS 10 μg/kg，放回笼中观察，自由饮水进食。24 h后快速放血处死兔，取血观察其相关生化指标的改变及观察动物内脏变化及游离气管和肺脏，取出全肺计算肺系数，以判断MODS模型建立成功。随后取兔肝脏组织以备实验。

1.3 引物设计

参照Halvorsen等方法和Genebank序列，Premier5.0软件设计引物（北京三博远志生物技术有限责任公司合成）。PPAR-γ引物：上游5'-TGACAGGAA AGACGACAGACAAATC，下游5'-CCACTGAGAATGATGACGGCTATG。GAPDH引物：上游5'-GATTCCACCCAC GGCAAGTTC，下游5'-ACTCGGCACCAGCATCACC。

1.4 肝组织PPAR-γ mRNA的表达

将PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像分析系统对其进行图像扫描，采用LEICAQ-500IW图像分析处理系统进行分析测定光密度OD值，以目的片段的OD值和GAPDH的OD值之比作为PPAR-γ的表达水平。

1.5 统计学处理

计量数据采用均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS13.0软件分析，进行方差分析及t检验，P < 0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 各空白组PPAR-γ mRNA在各组兔肝脏组织中的表达

各组兔肝脏中PPAR-γ mRNA的表达结果见表1。T-H空白组较之sham空白组中PPAR-γ mRNA的表达下降，具有显著性差异（t = 2.7447，P < 0.05），D-H空白组较之sham空白组中PPAR-γ mRNA的表达下降，具有显著性差异（t = 2.7377，P < 0.05），而T-H组与D-H组中PPAR-γ mRNA的表达无统计学意义（t = 0.2476，P > 0.05）。

2.2 T-H组及D-H组中PPAR-γ mRNA在各组兔肝脏组织中的表达

在T-H组中，兔肝脏组织中PPAR-γ mRNA的表达结果见表1。罗格列酮组较空白组明显升高，具有显著差异（t = 9.132 9，P < 0.05）。GW9662组较之罗格列酮组明显下降，具有统计学意义（t = 9.440 4，P < 0.05）。在D-H组中，兔肝脏组织中PPAR-γ mRNA的表达结果见表1。罗格列酮组较空白组明显升高，具有显著性差异（t = 8.615 5，P

3 讨论

临床中的MODS往往是多元性和序贯性损伤的结果，而不是单一打击的结果。根据Dietch提出MODS的二次打击学说，将创伤、感染、烧伤、休克等早期直接损伤作为第1次打击，虽不足以引起明显的临床症状，但早期损伤激活了机体免疫系统，炎症细胞已经动员起来，处于预激活状态[2]。如病情进展恶化或继发感染、休克等情况，则构成第二次打击，使处于预激活状态的机体免疫性系统爆发性激活，大量炎症细胞活化、炎症介质释放，结果炎症反应失控，导致组织器官的致命性损害。因此，通过对炎症因子的调节，阻断炎症反应的过程，改善组织器官的功能成为MODS诊断和治疗的新途径，有许多学者都希望通过这一途径调节免疫反应，治疗MODS[3]。

PPAR-γ能够通过调节如TNF-α、IL-6、ICAM-1及NF-κB等炎症因子表达，参与机体炎症反应过程，抑制单核-巨噬细胞活化，减轻炎症细胞浸润和减少炎性介质释放等而发挥抗炎作用[4]。PPAR-γ配体或激动药分为天然和合成两大类。15d-PGJ2是目前最强的PPAR-γ天然激动剂，但15d-PGJ2在活体中存在极少。噻唑烷二酮（TZDs）类药物是PPAR-γ的高亲和力合成配体，其代表药物包括曲格列酮、吡格列酮、罗格列酮、环格列酮等，均可在毫微克分子浓度水平激活PPAR-γ，因此在本课题组先前的研究中发现，在由LPS诱导的MODS动物模型肝脏组织中，LPS通过CD14/TLR4等途径激活NF-κB，从而引起炎症介质的大量释放。而PPAR-γ的激动剂罗格列酮能够上调巨噬细胞中PPAR-γ的表达，通过抑制NF-κB，抑制促炎因子TNF-α、IL-12、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和NO等的产生，促进抑炎因子IL-10等的产生。PPAR-γ使促炎因子和抑炎因子的表达平衡重新建立，抑制炎症反应的过度发展，防止了全身炎症反应综合症（SIRS）的发生，进而保护了组织器官，而GW9662作为PPAR-γ激动剂的拮抗剂，抑制了激动剂的作用，出现了SIRS，进一步可以引起MODS[1，5]。本实验通过建立由失血性休克后液体复苏及LPS刺激的方法建立了二次打击MODS模型，从而探讨PPAR-γ在二次打击MODS模型的不同的阶段，在肝脏组织中的表达。我们观察到，在受到失血性休克及液体复苏后PPAR-γ的表达相对于假手术组下降，在二次打击后其表达相对于假手术组仍是降低的，但是和失血性休克及液体复苏组没有显著性差异。在使用PPAR-γ的激动剂罗格列酮后，H-T组及D-T组中PPAR-γ的表达均得以升高，使用GW9662后H-T组及D-T组中PPAR-γ的表达均下降。

综上所述，在二次打击导致的MODS模型中，PPAR-γ在MODS发展过程中均能被其激动剂或拮抗剂所作用，但是PPAR-γ在发展过程中是否能够起到相应的阻断炎症反应的作用，是我们下一步所要重点关注的。

[参考文献]

[1] 乔万海，屈莉，师猛，等. MODS大鼠外周血中PPARγ与TNF-α和IL-10动态变化的研究[J]. 第四军医大学学报，2009，30（8）：690-693.

[2] Andreas. Lenz，Glen.A. Franklin and WilliamG. Cheadle，Systemic inflammation after trauma [J]. Injury 2007，38（10）：1336-1345.

[3] Elizabeth A. Sailhamer，Yongqing Li，Eleanor J. Smith et al. Acetylation：a novel method for modulation of the immune response following trauma/hemorrhage and inflammatory second hit in animals and humans[J]. Surgery，2008，144（8），204-216.

[4] Lajos Széles，Dániel T■r■csik，László Nagy. PPARγ in immunity and inflammation：cell types and diseases[J]. Biochimica et Biophysica Acta（BBA）-Molecular and Cell Biology of Lipids，2007，1771（8），1014-1030.

[5] 乔万海，王静，师猛. 罗格列酮对脂多糖诱导的多器官功能障碍综合征大鼠保护作用的研究[J]. 中国急救医学，2007，27（6）：550-552.

（收稿日期：2012-10-30）