HPLC测定恩替卡韦原料药含量及有关物质

【摘 要】目的：用反相HPLC法测定恩替卡韦原料药的含量及有关物质，为恩替卡韦原料药的含量和有关物测定提供检测方法，制定质控标准。方法：用十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂，以乙腈-水-三氟乙酸（2：98：0.1）作为流动相，检测波长为254nm，柱温为室温。流速为1.0mL・min-1。结果：主峰能与相邻杂质峰较好分离，恩替卡韦的浓度在0.06～0.14 mg・mL-1范围内线性关系良好，相关系数为0.9992。结论：该法简便、准确、专属性好，可用于恩替卡韦原料药的含量及有关物质的测定。

【关键词】恩替卡韦；含量测定；有关物质；高效液相色谱法

【中图分类号】R917 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）02-0293-02

恩替卡韦是由美国百时施贵宝（Bristol Myers Squbb）公司在20世纪90年代开始研制开发的一种新型抗乙肝病毒新药，对HBV、DNA复制的起始、逆转病和DNA正链合成等3个阶段均起抑制作用，具有很高的抗HBV作用，且细胞毒性很低[1]，属于已在国外上市销售但尚未在国内上市销售的原料药。关于本品的含量测定和有关物质检查国内外尚未见国内外文献报道。本文采用RP-HPLC法测定恩替卡韦的含量和有关物质，并选用常用的C18柱。本法灵敏度高，专属性强，重现性好，结果准确可靠。

1 仪器和试药

LC2050高效液相色谱仪，LC2030型紫外检测器，LC2130 泵（均为上海天美科学仪器有限公司生产）；乙腈（色谱纯） ；盐酸与氢氧化钠（均为分析纯）；样品：恩替卡韦原料药（自制，批号：20090601，20090602，20090603）；对照品：恩替卡韦（美国进口，含量为99.5%，）。

2 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：waters C18柱（250mm×4.6mm，5μm） ；流动相为乙腈-水-三氟乙酸（2：98：0.1）；流速：1ml・min-1；检测波长为254nm；柱温：室温，理论板数按恩替卡韦峰计不低于10000，各杂质峰均能与主峰基线分离。结果见图1。

A.空白（blank） B.恩替卡韦样品（ entecavir sample）

1.恩替卡韦（entecavir）

3 方法与结果：

3.1 溶液的制备

3.1.1 对照品溶液的制备 精密称取对照品10.25mg，置100ml容量瓶中，加0.1%三氟乙酸溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

3.1.2 供试品溶液的制备 精密称取样品10.59mg，置100ml容量瓶中，加0.1%三氟乙酸溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

3.2 方法专属性考察

取本品适量，分别进行以下操作：①热破坏：取本品适量，置表面皿中铺成≤5mm厚的薄层，置于200℃干燥箱加热破坏1小时。称取本品适量，加0.1%三氟乙酸制成每1ml约含0.1mg浓度的溶液，滤过，即得；②酸破坏：取本品约10mg，加浓盐酸溶液5ml，置水浴中加热30分钟，放冷，用饱和氢氧化钠溶液中和后，转移至100ml量瓶中，用0.1%三氟乙酸稀释到刻度，摇匀，滤过，即得；③碱破坏：取本品约10mg，加饱和氢氧化钠溶液5ml，置水浴中加热2小时，放冷，用浓盐酸中和后，转移至100ml量瓶中，用0.1%三氟乙酸稀释到刻度，摇匀，滤过，即得；④氧化破坏：取本品约10mg，加入30%过氧化氢溶液1ml，置水浴中加热2小时，转移至100ml量瓶中，用0.1%三氟乙酸稀释到刻度，摇匀，滤过，即得。结果上述操作方法中有关物质含量显著增加，且降解产物均与恩替卡韦主峰获得良好分离，表明本色谱条件测定恩替卡韦的含量及其有关物质的方法专属性良好。见图2。

3.3 线性范围 精密称取恩替卡韦对照品适量，用0.1%三氟乙酸稀释成每1ml约含0.06、0.08、0.10、0.12和0.14mg的溶液，摇匀，分别取各溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，量取峰面积。以恩替卡韦的峰面积（A）为纵坐标（Y），以对照品的浓度C（mg・mL-1）为横坐标（X），按最小二乘法进行线性回归，求得线性回归方程：A=57578497.8C+63621.28 r=0.9992。

恩替卡韦在0.06～0.14mg・mL-1 浓度范围内，线性关系良好。

3.4 进样精密度 取线性关系考察项下浓度为0.10 mg・mL-1的对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，结果RSD为0.25%。

3.5 稳定性试验 精密称取批号为20090601的样品适量，加流动相制备成0.10mg・mL-1L的溶液，摇匀，作为样品溶液，分别在0，2，4，6，8h取样，测定峰面积。结果RSD为0.45%，表明样品溶液8h内较为稳定。

3.6 检测限 取线性关系考察项下浓度为0.10 mg・mL-1的对照品溶液，用0.1%三氟乙酸依次稀释成0.01，0.001，0.0001 mg・mL-1的溶液，各进样20μl，结果在浓度为0.0001mg・mL-1时，主产物信号约为噪音的3倍，即检测限为2ng。

3.7 回收率试验 精密称取恩替卡韦样品10mg，置200ml容量瓶中，用0.1%三氟乙酸溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得样品溶液；同法制得对照品溶液。共制备6份样品溶液，分取上述溶液20μl注入液相色谱仪，计算回收量、回收率，结果平均回收率为100.8%（n=6），RSD为0.94%。

3.8 重复性试验 称取20090601批样品6份，按上述方法制备样品溶液并进行含量测定，结果6份平均含量为99.6%，含量的RSD为0.65%（n=6）。

3.9 样品含量测定

按上述方法对另外2批恩替卡韦进行含量测定，结果20090602和20090603样品含量分别为99.3%，99.2%。

3.10 样品有关物质的测定

取恩替卡韦样品适量，加0.1%三氟乙酸使溶解并稀释制成浓度为0.1mg・mL-1的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液2ml， 置100ml容量瓶中， 用0.1%三氟乙酸稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液. 量取对照溶液20μl注入色谱仪，调节检测灵敏度，使主峰的高度约为记录仪满量程的20%。精密量取供试品溶液20μl注入色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的3倍。供试品溶液的色谱图中如显杂质峰，扣除空白溶剂峰，根据各杂质峰面积的和，与对照溶液主成分峰面积比较计算单个杂质和总杂质的量。测定结果见表1。

4 讨论

4.1 色谱柱的选择 本研究参考新药研究指导原则[2]，选用C18色谱柱作为试验用柱，并结合合适的流动相，结果显示，主药与有关物质能很好地分开，且主峰峰形好，柱效高，故选择C18色谱柱作为本试验的色谱柱。

4.2 流动相的选择 曾比较了乙腈-水（2：98），甲醇-水（5：95），乙腈-水-三氟乙酸（2：98：0.1）等3种流动相的分离情况，发现乙腈-水-三氟乙酸（2：98：0.1）分离效果好，且峰形比较好，故选择该流动相。

4.3 检测波长的选择 以0.1%三氟乙酸为溶剂，配置0.1 mg・mL-1的溶液，在200～400nm范围内扫描，结果表明，在254nm波长有最大吸收，故将254nm作为检测波长。

4.4 结论 使用本方法测定恩替卡韦原料中恩替卡韦的含量和有关物质，方法简便、准确，重复性好。

参考文献：

[1] 李颖.抗乙肝病毒新药恩替卡韦的研究进展.[J].继续医学教育，2009，18（4）：48～49

[2] 《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》[S]，2010.