HPLC法测定羧甲司坦无糖口服溶液中羧甲司坦的含量及有关物质

时间:2022-10-08 07:13:05

HPLC法测定羧甲司坦无糖口服溶液中羧甲司坦的含量及有关物质

【摘要】 目的 建立羧甲司坦的含量测定及有关物质检测的方法。方法 采用hplc法,以c18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)为色谱柱,以0.68%磷酸二氢钾和0.05%己烷磺酸钠(ph2.5)为流动相,检测波长为215 nm。结果 羧甲司坦在0.44~1.3 mg·ml-1范围内,峰面积与质量浓度呈良好的线性关系(r=0. 999 9),平均回收率为99. 5%,rsd为1.1%(n=9),最低检测限为 8.27 ng,各杂质峰与主峰达到基线分离。结论 本法简便、专属性及重现性好,可用于羧甲司坦含量及有关物质的测定。

【关键词】 羧甲司坦 反相高效液相色谱法 有关物质

羧甲司坦为半胱氨酸的巯基取代衍生物,2005年版 中国 药典收裁了该品种(含糖型),采用茚三酮显色比色法测定其含量[1],也有 文献 报道采用hplc蒸发光散射检测法[2]和柱前衍生荧光检测法[3]与反离子对色谱法[4]测定其含量和有关物质。本文采用反相离子对液相色谱法测定羧甲司坦的含量和有关物质,试验结果表明,该方法简便、专属性强、准确度高和重现性好。

1 仪器与试药

美国agilent1100高效液相色谱仪,二极管阵列检测器(dad),chemstation system 工作站。

羧甲司坦对照品(中国药品生物制品检定所),羧甲司坦口服溶液(无糖型,批号:051101、051102、051103, 规格:0.2 g/10 ml,由广州白云山制药总厂提供),己烷磺酸钠(分析纯,由pure chemical analysis co.,ltd.提供),其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 溶液的制备 对照品溶液的制备: 精密称取羧甲司坦对照品50 mg,置50 ml量瓶中,加0.1 mol·l-1naoh溶液5 ml,使溶解,并加水稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。

供试品溶液的制备:精密量取本品适量,加水稀释制成每1 ml中约含羧甲司坦1 mg的溶液。

空白辅料溶液的制备:取辅料适量,按照处方配比,制成不含主药羧甲司坦的空白溶液。

2.1.2 色谱条件和系统适用性试验 色谱柱:diamonsil c18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相:0. 68%磷酸二氢钾和0.05%己烷磺酸钠,用磷酸调ph值2.5;检测波长:215 nm;进样量:10 μl。理论塔板数按羧甲司坦 计算 为5 000,羧甲司坦峰与相邻峰的分离度符合规定,阴性对照无干扰。色谱图见图1。

a.羧甲司坦对照品;b.羧甲司坦无糖口服溶液供试品;c.阴性对照品 1.羧甲司坦

图1 羧甲司坦无糖口服溶液的hplc谱图(略)

figure 1 hplc of chromatogram

2.1.3 线性试验 精密称取羧甲司坦对照品适量,置100 ml容量瓶中,加0.1 mol·l-1naoh溶液5 ml,使溶解,加水稀释制成每1 ml中约含羧甲司坦2.2 mg的贮备液,分别精密量取适量,配制成系列浓度,按上述色谱条件测定,以羧甲司坦的质量浓度(ρ)对其相应的峰面积(a)作回归方程,结果在0. 44~1.3 mg·ml-1浓度范围呈良好的线性关系:a=1966.1ρ+16.771,r=0.999 9(n=6)。

2.1.4 精密度试验 取同一份对照品溶液,连续进样6次,结果峰面积和保留时间的rsd分别为0. 14%和0.45%,表明试验精密度良好。

2.1.5 重复性试验 精密量取羧甲司坦口服溶液适量,平行6份,分别测定含量,结果其rsd为0. 60%。

2.1.6 稳定性试验 制备供试品溶液,分别在0、2、4、6 h进样,6 h内测定结果的rsd为0.35%。

2.1.7 空白加样回收率试验 按处方比例制备空白对照液,分别加入3种比例的羧甲司坦对照液,按“2.1.2”项色谱条件进样测定回收率,结果平均回收率为99.5%,rsd为1.1%,见表1。

2.1.8 样品的测定 取供试品(批号 051101、051102、051103)按“2.1.1”项方法制备供试液,并按“2.1.2”项色谱条件进样测定,3批供试品的平均含量分别为101.1%、101.9%、101.4%。

2.2 有关物质测定

2.2.1 测定法 量取本品适量,加水稀释制成每1 ml中含羧甲司坦2 mg的溶液作为供试品溶液;精密量取1 ml,置100 ml量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液;按“2.1.2”项下的色谱条件,取对照溶液10 μl,注入液相色谱仪,调节检测灵敏度,使主成分色谱峰的峰高约为满量程的30%;精密量取供试品溶液与对照溶液各10 μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。

表1 羧甲司坦加样回收率试验结果(略)

table 1 results of recovery test

2.2.2 专属性 对照品溶液:精密称取羧甲司坦对照品50 mg,置50 ml量瓶中,加0.1 mol·l-1naoh溶液5 ml,使溶解,并加水稀释至刻度,摇匀,作为对照品溶液。

羧甲司坦+半胱氨酸溶液:用对照品溶液制成每1 ml含半胱氨酸0.5 mg的混合溶液。

酸水解产物:量取本品2 ml,置50 ml量瓶中,加0.1 mol·l-1hcl溶液10 ml,加水稀释至刻度,摇匀。

碱水解产物:量取本品2 ml,置50 ml量瓶中,加0.1 mol·l-1naoh溶液10 ml,加水稀释至刻度,摇匀。

热分解产物:取本品1支,置沸水中加热10 min,冷却,量取2 ml,置50 ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀。

强光破坏产物:取本品,在(4500±500)lx下光照2 d后,量取本品2 ml,置50 ml量瓶中, 加水稀释至刻度,摇匀。

氧化降解产物:量取本品2 ml,置50 ml量瓶中,加过氧化氢0.1 ml,加水稀释至刻度,摇匀。

阴性对照液:取口服溶液的空白辅料适量,用水制成每1 ml含羧甲司坦1 mg的辅料溶液。

取上述溶液分别进样检测。色谱图见图2,有关物质测定结果见表2。

表2 有关物质测定结果(略)

table 2 results of the related substances determination

图2 降解产物的色谱图(略)

figure 2 hplc chromatogram of degradation products

2.2.3 最低检测限 羧甲司坦的最低检测限为 8. 27 ng。

2.2.4 不同ph值对产品稳定性的影响 用磷酸盐缓冲溶液配制ph值分别为5.5、5.9、6.5、7.0、7. 9、8.1的供试品溶液,按上述方法测定,结果见表3。

表3 不同ph值的试验结果(略)

table 3 results of stability at various ph values

3 讨论

3.1 羧甲司坦为强酸性化合物,分离强酸性化合物常用的离子对试剂是烷剂磺酸盐,经试验:流动相中以0.05%己烷磺酸钠为离子对时,保留时间约为5 min,杂质可达到基线分离,因此选择己烷磺酸钠作为离子对试剂。

3.2 从羧甲司坦对照品的二极管阵列检测器紫外扫描图看出,羧甲司坦有紫外末端吸收,因此检测波长选择215 nm。

3.3 有关物质专属性研究的图谱提示:(1)半胱氨酸是羧甲司坦合成的前体,羧甲司坦口服溶液在酸、碱、热、强光、氧化条件下被破坏产生的杂质并不是水解产物半胱氨酸;(2)本品在强酸、强碱性、热、强光、氧化破坏条件下,羧甲司坦口服溶液均产生保留时间为11.5 min的主杂质峰,推测可能为羧甲司坦的双分子聚合物,有待进一步证实。

3.4 ph值对供试品稳定性的影响试验结果表明:室温时,ph值对供试品溶液的含量和有关物质的影响不大;供试液经100 ℃加热15 min后,当ph值>7.4时,有关物质明显增加,故羧甲司坦口服溶液生产制备时不宜采用高温消毒。

3.5 中国 药典收载的羧甲司坦口服溶液(含糖型),有ph值降低现象,而无糖型产品经18个月的稳定性考察,溶液的ph值较稳定。

3.6 经方法学验证,本法简便、准确,灵敏度高,重复性好,可用于羧甲司坦无糖口服溶液的含量测定和有关物质检查。

【 参考 文献 】

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2005年版:一部[s].北京:化学 工业 出版社,2005:817.

[2] 陈秀琳,郑小力.hplc?elsd法测定羧甲司坦颗粒中羧甲司坦的含量[j].

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