PDE5 shRNA对心肌细胞凋亡的保护作用

【摘要】 目的 探讨抑制磷酸二酯酶5的短发夹RNA重组腺病毒载体pde5 shrna对缺氧缺糖条件下乳鼠心肌细胞的保护作用。方法 培养新生C57BL/6J小鼠心肌细胞，通过缺氧缺糖，建立小鼠心肌细胞缺氧缺糖损伤模型，分实验组（shPDE5）和对照组（Null），实验组：通过构建抑制磷酸二酯酶5的短发夹RNA重组腺病毒载体（PDE5 shRNA），将PDE5 shRNA转染心肌细胞，对照组（Null）：将没有插入PDE5 shRNA的普通腺病毒载体转染心肌细胞。利用TUNEL法检测各组细胞凋亡情况。结果 与对照组比较，细胞在缺氧缺糖条件下，实验组细胞凋亡明显减少（P

【关键词】 短发夹RNA；干预治疗；磷酸二酯酶5；心肌细胞

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.035 文章编号：1004-7484（2013）-06-2893-02

病理性细胞凋亡是心肌细胞丧失的形式之一，是心血管疾病发生和发展的基础[1]。心肌细胞凋亡既是心肌细胞损伤的一种反应，同时又是心功能受损的一个重要参与因素。因此，减少心肌细胞凋亡，可能会减轻心室重构，减轻心肌纤维化，改善心脏功能，抗细胞凋亡成为心力衰竭生物治疗的一个新方向。越来越多的证据表明PDE5与心血管系统疾病有密切的关系。最近研究表明PDE5在晚期心力衰竭患者心肌中表达增加，并且会加重心衰患者的心室重构，可能是由于cGMP/PKG信号的下降，加剧心功能恶化[2]。RNA干扰是近年发现的一种由双链RNA引发的转录后基因沉默机制，能特异性地抑制靶基因的表达，具有快速、高效、容易操作、序列特异性强等优点[3-4]。本实验通过构建磷酸二酯酶5的短发夹RNA重组腺病毒载体（PDE5 shRNA），研究其对缺氧缺糖条件下乳鼠心肌细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物新生C57BL/6J小鼠购自大连医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK（辽）2008-0002），用于乳鼠心肌细胞的培养。

药品与试剂DMEM培养基、FBS购自美国Sigma公司，TUNEL试剂盒购自Promega公司，cGMP、PKG试剂盒购自美国SantaCruz公司。

1.2 方法 shRNA重组腺病毒载体构建我们根据鼠的PDE5A序列设计PDE5短发卡RNA，两个互补PDE5的寡核苷酸序列是：SENSE 5`-GATCCGGAGC AGCAGTCATT GGAAGTCGAA ACTTCCAATG ACTGCTGCTC CTTTTTTG-3` and ANTISENSE 5`-AATTCAAAAA AGGAGCAGCA GTCATTGGAA GTTTCGACTT CCAATGACTG CTGCTCCG-3`.根据鼠PDE5序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并克隆进入载体pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector，获得鼠PDE5的shRNA表达载体质粒（pSIREN-DNR-PDE5-shRNA-DsRed）。然后将供体注入到骨架腺病毒pLP-Adeno-X LP CMV，获得pLP-Adeno-PDE5 shRNA，没有插入shRNA的普通腺病毒载体作为对照组（Null），然后将携带有PDE5 shRNA的腺病毒载体（shPDE5）和普通的腺病毒载体（Null）分别转染HEK 293细胞，放在DMEM和10% FBS混合培养液中培养，通过HEK293细胞扩增病毒，并经离心、提取、纯化制备高滴度重组腺病毒载体。

准备和培养转导的心肌细胞按照文献[6]从一日龄C57BL/6J小鼠提取心肌细胞，在含有10%FBS的DMEM培养液中37°C培养24小时，进行心肌细胞的鉴定。

分组及给药分为实验组和对照组，实验组（shPDE5）用浓度1X106个/ml的PDE5shRNA腺病毒转染心肌细胞，对照组（Null）转染等量未携带PDE5shRNA的腺病毒载体（Null），在正常条件下培养，培养16小时候在激光共聚焦显微镜下观察鉴定。

1.3 原位末端标记分析（TUNEL） 正常培养的心肌细胞，用缺糖Hanks液代替正常培养基，放在37°C饱含95%N2/5%CO2密闭容器中培养，细胞培养8小时之后，利用原位末端标记分析对各组心肌细胞进行细胞凋亡检测。

1.4 统计分析 用SPSSl7.0进行统计分析。计数资料以均数±标准差表示，均数比较用单因素方差分析（one―wayANOVA），P

2 结 果

2.1 PDE5shRNA转导鉴定 经PDE5 shRNA转导16小时以后，实验组大多数细胞在荧光显微镜下呈现红色，证明PDE5 shRNA腺病毒载体转到心肌细胞是成功的（图1）。

2.2 TUNEL阳性检测 细胞在缺氧缺糖条件下培养8小时后进行TUNEL分析显示，实验组的心肌细胞在缺氧缺糖条件下能够耐受细胞损伤，而对照组细胞对细胞损伤很敏感，细胞在缺氧缺糖条件下培养8小时之后，与实验组比较，对照组TUNEL阳性心肌细胞明显增加（图2）。

3 讨 论

RNA干扰是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）时，通过dsRNA介导特异性的使内源性mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默[6-7]。由RNAi现象产生的RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。

本研究发现，利用靶目标PDE5的短发夹RNA（PDE5 shRNA）对缺氧缺糖条件下心肌细胞干预治疗，通过抑制PDE5的表达明显拮抗缺氧缺糖诱导的心肌细胞凋亡。这些观察结果与早先的报道一致，即PDE5抑制剂西地那非可以拮抗心肌局部缺血引起的心肌细胞凋亡[8]，有研究者提出，cGMP/PKG信号通路在PDE5抑制剂抗心肌细胞凋亡方面起到非常重要的作用[9-10]，本实验结果证明，经过PDE5 shRNA 干预，细胞凋亡明显减轻，这些都高度提示cGMP/PKG信号通路在减少细胞凋亡方面起到核心作用。

总之，PDE5 shRNA明显拮抗缺氧缺糖诱导的心肌细胞凋亡，通过持续抑制心肌细胞PDE5基因表达对缺氧缺糖条件下心肌细胞发挥显著的保护作用。

参考文献

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