PDE5 shRNA对急性心梗后早期细胞凋亡的影响

【摘要】 目的 探讨PDE5 shRNA对小鼠急性心梗后早期细胞凋亡的影响。方法 通过结扎小鼠左冠状动脉前降支建立小鼠心肌梗死模型，随机分为实验组（n=10）：将携带有抑制PDE5的shRNA（PDE5 shRNA）重组腺病毒载体注射到心肌梗死区及周边区和对照组（n=10）：将没有插入PDE5 shRNA的普通腺病毒载体注射到心肌梗死区及周边区。一周后，进行免疫组化和TUNEL分析检测梗死及梗死周边细胞凋亡情况。结果 心梗1周后，和对照组相比较，实验组小鼠梗死区及梗死周围区域细胞凋亡明显减少（P

【关键词】 短发夹RNA；干预治疗；心肌梗死；磷酸二酯酶5抑制剂

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.061 文章编号：1004-7484（2013）-06-2921-02

近年来，随着心肌梗死存活率的大幅提高，心肌梗死后心力衰竭的发病率和死亡率都呈明显上升趋势[1]，已逐渐成为全世界范围主要的发病和死亡原因之一，如何降低心肌梗死后心力衰竭的发病率和死亡率，是心血管病防治领域中的关键问题。尽管有一系列的治疗措施，心衰患者的预后仍不尽人意[2]。心肌梗死后心肌细胞凋亡是触发心室重构导致心力衰竭的重要原因，阻止梗死后心肌细胞凋亡可以减少心室重构，改善心功能[3]。早期干预有助于延缓心梗后心衰的进展，对心梗的远期预后有不可估量的益处。

最近研究表明PDE5在晚期心力衰竭患者心肌中表达增加，并且会导致心梗后心室重构[4]，可能是由于cGMP/PKG信号的下降，加剧心功能恶化。PDE5抑制剂对心脏有很多益处，通过持续抑制磷酸二酯酶可以减轻心肌梗死引起的心室重构和心功能恶化，本实验主要通过研究长效磷酸二酯酶5抑制剂短发夹RNA（PDE5 shRNA）重组腺病毒载体对小鼠急性心肌梗死模型心肌细胞凋亡的影响并探讨其可能的相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性10周龄C57BL/6J小鼠（由大连医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK（辽）2008-0002），体重25-35g。

1.2.2 药品与主要试剂 DMEM培养基、10%FBS（Sigma公司）；Desmin一抗（SantaCruz）；TUNEL试剂盒（Roche公司）。

1.2 方法

1.2.1 PDE5shRNA重组腺病毒载体的建立 根据小鼠的PDE5A序列设计PDE5短发卡RNA，两个互补PDE5的寡核苷酸序列是：SENSE 5`-GATCCGGAGC AGCAGTCATT GGAAGTCGAA ACTTCCAATG ACTGCTGCTC CTTTTTTG-3` and ANTISENSE 5`-AATTCAAAAA AGGAGCAGCA GTCATTGGAA GTTTCGACTT CCAATGACTG CTGCTCCG-3`.根据鼠PDE5序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并克隆进入载体pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector，获得鼠PDE5的shRNA表达载体质粒（pSIREN-DNR-PDE5-shRNA-DsRed）。然后将供体注入到骨架腺病毒pLP-Adeno-X LP CMV 获得pLP-Adeno-PDE5 shRNA，没有插入shRNA的普通腺病毒载体作为对照组，然后将携带有PDE5 shRNA和没有PDE5 shRNA普通的腺病毒载体分别转染HEK293细胞，放在DMEM和10% FBS混合培养液中培养，通过HEK293细胞扩增病毒，并经离心、提取、纯化制备高滴度重组腺病毒载体。

1.2.2 动物模型的制备及分组 实验用雄性C57BL/6J小鼠若干只，按照文献[5]的方法结扎冠状动脉前降支复制小鼠心梗模型，并将建立好的模型随机分为实验组（n=10）：将携带有抑制PDE5的shRNA（PDE5 shRNA）重组腺病毒（1x1010粒子/小鼠）注射到心肌梗死区及周边区和对照组（n=10）：将没有插入PDE5 shRNA的普通腺病毒载体以同样的方法注射到心肌梗死区及周边区。随后逐层关胸。手术严格无菌操作。

1.2.3 组织标本处理 心脏标本的留取一周后，所有存活小鼠麻醉状态下，迅速取出心脏，冰生理盐水冲洗干净，垂直心脏长轴将其评分为2段，部分心肌置入4%多聚甲醛溶液中固定，部分放置-80℃冰箱低温保存。

1.2.4 细胞凋亡原位检测 对梗死及梗死周边细胞采用TUNEL法检测，按照说明书操作，光镜下（20×20倍）观察，阳性细胞核为红色，随机选择5个无重叠视野，分别记数凋亡细胞数和细胞总数，二者百分比作为凋亡指数；随后对梗死周边心肌细胞采用双免疫荧光标记检测，首先以Desmin抗体为一抗进行染色，用TUNEL检测心肌细胞凋亡情况，DAPI用于着色细胞核，光镜下（20×20倍）观察，心肌细胞为绿色，阳性细胞核为红色，随机选择5个无重叠视野，分别记数凋亡细胞数和细胞总数，二者百分比作为凋亡指数。

1.3 统计分析 采用SPSS17.0统计软件包进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（χ±s）表示，两组间均数比较采用单因素方差分析，以P

2 结 果

2.1 各组小鼠细胞凋亡的情况 TUNEL（原位末端标记法）分析显示，与对照组比较，实验组梗死区及梗死周边区细胞凋亡数目减少（图1），这表明，PDE5 hRNA明显降低细胞凋亡发生率。

2.2 各组小鼠梗死周边心肌细胞凋亡的情况 与对照组比较，实验组小鼠梗死周边心肌细胞凋亡数目明显减少（图2），这表明，PDE5 shRNA明显降低心肌细胞凋亡发生率。

3 讨 论

心肌细胞凋亡是急性心肌梗死、心室重塑的重要病理改变，是导致心肌细胞减少的主要原因，从而造成心肌功能和结构的损害[6]。本实验利用靶向磷酸二酯酶5的短发夹RNA（PDE5 shRNA）对急性心梗干预治疗，可以明显降低PDE5基因表达、降低细胞凋亡发生率。

随着哺乳动物进化的演变，RNA干扰是一种固有的生物学现象[7]。生物学上，RNA干扰对短期和长期阻断蛋白表达有很重要的生理意义[8]。早先有报道称shRNA质粒可以在体内保持1-4周的活性时间[9]，将shRNA作为一些特殊基因表达的靶基因，可能成为人类用作长期预防一个非常有效的策略。于当今治疗心脏疾病的策略相比，这一新策略不用反复吃药就能提供长期有效地预防保护作用。在这项研究中，我们选择PDE5作为目标。PDE5在组织和肺血管系统中对平滑肌的作用很早就被公认[10]。一篇最近的文献报道，PDE5在心肌病病人左室表达增加，并且在心梗后导致心室重构[11]。

细胞凋亡是由遗传基因决定的程序性细胞死亡，可以被一些刺激激活，例如生长因子的减退，凋亡受体信号或者细胞应激。我们的免疫荧光检测分析表明，PDE5 shRNA治疗可以明显降低梗死周边区域的心肌细胞凋亡，这些观察结果与早先的报道一致-即PDE5抑制剂西地那非可以拮抗心肌局部缺血引起的心肌细胞凋亡[12]，有人提出，cGMP/PKG 通路在PDE5抑制剂抗心肌细胞凋亡方面起到非常重要的作用[13]。我们的实验观察到体内实验经过PDE5 shRNA治疗，PDE5 shRNA对心肌细胞和非心肌细胞在梗死及梗死周边区域的抗凋亡作用可以减轻心梗后心室重构及心脏功能障碍。

总之，急性心肌梗死后PDE5 shRNA干预可以通过抑制PDE5表达明显减轻细胞凋亡，这些发现或许可以为治疗急性心肌梗死后的慢性心功能不全提供新的治疗思路。

参考文献

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