影响血友病A基因治疗效果的因素分析

【中图分类号】R331.1

【文献标识码】A

【文章编号】2095-6851（2014）05-0583

A型血友病是临床上最常见的血友病，约占血友病人数的80%-85%，是一种X连锁隐性遗传病，其发病原因是由于编码凝血因子Ⅷ的基因突变导致凝血因子Ⅷ（FⅧ）合成减少或者功能缺陷，本文就A型血友病基因治疗中影响基因治疗效果的各因素的作一综述。

R554.1

1载体因素

1.11逆转录病毒载体 此种载体的优点是能将外源基因较好的整合到宿主细胞的染色体中，缺点在于其长末端重复序列的启动子功能在体内容易失活，以致表达时间短暂。有学者通过观察减毒的逆转录病毒载体插入V79细胞基因组后的诱变效应，发现在63%的病毒诱导的HPRT突变体中，当有较多（>3/基因组）前病毒插入时，结果显示HPRT基因位点不稳固，在分子水平发生了重组，但是当前病毒拷贝数在1-2/基因组时，却没有发现重组。

1.12慢病毒载体 此类载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达，而且可以不被之前存在的免疫干扰，慢病毒载体在活体血友病治疗和中枢神经系统传递中的应用中效果良好，当传递给新生的A型血友病的老鼠时，应用慢病毒载体来传递FⅧ转基因时表现出了有前景的结果，良好的载体设计可以提高载体安全性并且使之成为更有效的基因传递系统。

1.13腺病毒载体 腺病毒是一种双链无包膜DNA病毒，它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，但不整合到宿主细胞基因组中，安全性高，并增加了载体的稳定性，腺病毒载体转基因效率高，可转导不同类型的人组织细胞，促进转基因的高水平表达，还可以减少插入突变和基因位置效应，但此载体容易引起免疫反应，产生针对病毒衣壳的抗体，而且随着细胞的分裂增殖，载体基因会慢慢丢失，使之不能持续表达。另外，腺病毒载体的炎症反应可能是由于病毒分子或病毒衣壳引起，腺病毒衣壳可以激活一系列信号途径，激活炎性基因的表达，而且炎性基因的表达有剂量依赖性。

1.14腺相关病毒载体 此载体是一种单链DNA病毒，能转染分裂和非分裂细胞，对人类不具有致病性， 虽然能引起轻微的体液免疫反应， 但不会导致细胞毒性淋巴细胞反应， 因而具有较高的安全性、高效性、较低的免疫源性等优点。其缺点在于其可以装载的基因容量有限，目前基因治疗中应用较多的是AAV8血清型，最近描述的一种血清型rh10，是腺相关病毒的一个进化枝，有着合适的生物学特性，可以用作新生儿肝定向基因转移的载体，因为在新生儿的迅速生长期，此载体含有高水平的基因表达和持久的载体拷贝数，重组型腺相关病毒（rAA）由于它的一系列性质如在人类细胞中它没有异常状态和自然倾向，使得它适合用于基因治疗。

2靶细胞因素

2.1肝细胞：肝细胞是高度分化的细胞，但他们的分裂潜能表明肝细胞都有干细胞样特性，具有很强的自我更新能力，基因治疗时，高效能的基因转移往往发生在活跃的肝、脾等单核巨噬系统，腺病毒靶向于肝脏后产生达到治疗水平的hF8因子，在8因子缺陷的小鼠体内能持续表达数月。但当血友病患者又感染了乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒时， 就增加了治疗的复杂程度， 因此他们不适合采用靶向肝脏的基因治疗策略，必须将凝血因子在除肝脏以外的器官中进行表达。

2.2骨髓基质细胞 此种细胞的获取相对容易，可以通过抽取骨髓后进行培养而得，骨髓基质细胞生长于血液循环丰富的骨髓内，又能表达外源基因，是A型血友病基因治疗中很好的靶细胞之一，研究表明人或鼠的骨髓基质细胞能表达相当高水平的FⅧ ，是一种骨髓源性的A型血友病基因治疗的靶细胞。

2.3血小板：在血友病基因治疗中，血小板由于分泌凝血因子而被作为一种新的靶细胞，为了扩展血小板介导的基因治疗的应用，有学者利用患A型学友病的老鼠，测试了通过在血小板表面产生凝血酶，激活的在血小板FⅧ的异位表达是否能产生一个有效的治疗途径，结果在血小板中产生了有效的转基因表达，通过这种载体系统在血小板产生了激活的FⅧ子。FⅧ转基因产物在激活后的细胞质、细胞亚膜和细胞表面发现，与FⅧ制品直接输入的治疗方法相比，虽然血小板产生的没有FⅧ达到治疗水平，但在患A型学友病的老鼠模型中，结果显示血液的凝固性有很大提高，在治疗血友病和其他出血性疾病方面非常有用。

3治疗时机的影响

A型血友病的基因治疗效果受多方面因素的影响，其中治疗时机也是一个重要因素，早期新生儿或子宫内时的A型血友病易采用基因治疗，由于AAV能产生中和抗体，所以选择合适的血清型非常重要，血友病的临床治疗显示AAV2、AAV5、AAV8血清型在这些载体应用几年以后都出现了中和抗体，而且AAV2中和抗体的产生与AAV5和AAV8中和抗体的产生存在交叉反应，在年轻的血友病患者会由于较低的中和抗体产生而有更好的疗效，所以A型血友病的治疗越早越好。

4载体引起的免疫反应及外源因子不能持续表达

虽然替代治疗可以有效的延长患者寿命和提高生活质量，但还是不能消除出血的风险，在A型学友病的治疗中，常常由于抑制性抗体的出现，不能达到持续的、有效的FⅧ血清水平，有学者评估了一种改进过的慢病毒转导策略，通过合成一种微RNA目标序列，更有利于肝的转基因表达，而且可以阻止造血干细胞的不相关表达，加上微RNA调节的FⅧ转基因，可以产生持续的，达到治疗水平的FⅧ浓度。在A型血友病的小鼠中，应用重组腺相关病毒载体的A型学友病基因治疗常由于FⅧcDNA的大小而受阻，所以有学者探索出了把FⅧ编码序列分离为重链片段和轻链片段的双重AAV载体，但这个方法的缺点是轻链分泌FⅧ的比重链多。

综上所述，影响A型学友病基因治疗的疗效的因素有很多，其中最重要的是载体引起的免疫反应，外源因子不能持续表达，近几年针对这些问题，不少学者进行了研究，发现了一些列的改进方法，对于A型血友病的基因治疗具有重要意义。