微藻对氯霉素敏感性研讨

引言

近年来，能源短缺和环境污染问题日趋严重，因此，开发一种绿色可持续的替代性能源具有重要意义。生物柴油以其突出的环保性和可再生性特点成为世界各国政府和科学家关注的焦点［1］。微藻生长速度快、光合效率高、适应能力强，能大量积累储藏性三酰甘油(TAG)，被作为制备生物柴油的理想原料。目前，国内外对微藻生物柴油的研究主要集中在富油微藻的筛选和优化培养等方面［2－5］。通过基因工程和诱变等手段是选育高品质能源微藻较为理想的途径和手段。在诱变育种工作中，突变株的筛选是关键。抗生素抗性筛选法因其简单、快速有效而广泛用于微生物的诱变育种中［6］。在微藻诱变育种研究中，亦有关于微藻对抗生素的敏感性报道［7，8］，但不同微藻对抗生素的敏感性不同。本实验室前期研究证实绿藻栅藻(Scenedesmussp.)、斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)和爪哇栅藻(Scenedesmusjavaensis)具有高效产油潜力，另3种土壤真眼点藻(Eustigmatos)生物量高，具有重要的经济价值［9，10］。本文以6种微藻为研究对象，首次研究了这6种微藻对氯霉素和硫酸新霉素的敏感性，旨在获得适合筛选这6种微藻突变株的抗生素，为经济微藻的藻种选育提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料实验所用的3种绿藻(斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)、栅藻(Scenedesmussp.)、爪哇栅藻(Scenedesmusjavaensis)和3种真眼点藻［波氏真眼点藻(Eustigmatospolyphem)、魏氏真眼点藻(Eustigmatosvischeri)、点状魏氏藻(Vischeriapunctata)］由暨南大学水生生物中心微藻生物能源与生物技术实验室保藏。1.1.2试剂氯霉素和硫酸新霉素均购自Sigma公司，配制50mg•mL－1抗生素母液放置冰箱中4℃保存。

1.1.3仪器血球计数板(上海求精生化试剂仪器有限公司);光学显微镜(日本尼康公司)。1.1.4培养基BG－11液体培养基;固体培养基在液体培养基中加入1.5%的琼脂。

1.2方法

1.2.1微藻培养方法采用BG－11培养基培养，培养温度为(24±1)℃，光照强度约为20μmol•m－2•s－1，24h持续光照。将保种的藻种每6d进行一次继代培养，活化3次，每天摇瓶3～5次，待进入对数生长期，用于抗生素敏感性实验。

1.2.2微藻对抗生素敏感性测定方法

1.2.2.1藻液细胞计数法———血球计数板法取对数生长期的藻液调整细胞密度至2.5×106•mL－1，按20%的接种量接入到100mL锥形瓶中，分别加入不同浓度的抗生素(表1，抗生素浓度梯度由预实验确定)，每个浓度设置3个平行组，光照培养。每24h取样，血球计数板计数，测定细胞数目，并观察藻液颜色变化。

1.2.2.2微藻细胞固体平板培养法不同浓度抗生素的固体培养基中，每个浓度设3个平行组，培养3w，观察记录微藻生长状况。

1.2.3数据统计与分析用SPSS17.0对处理组和对照组数据进行组间差异性分析。

2结果与分析

2.1液体培养6种微藻对2种抗生素的敏感性2.1.1液体培养6种微藻对氯霉素的敏感性在抗生素敏感性试验中，实验浓度范围内氯霉素对3种真眼点藻的生长均无明显的影响，显微镜下观察，藻细胞形态并无明显差异(图1a，b，c)，说明3种真眼点藻对氯霉素均不敏感。氯霉素对栅藻、斜生栅藻和爪哇栅藻的生长具有较强抑制作用，10μg•mL－1的氯霉素即可抑制3种绿藻的生长(图1d，e，f)。在加入氯霉素培养的前2d，氯霉素对这3种绿藻生长无明显抑制作用(P＞0.05);从第3d开始，氯霉素对3种绿藻的抑制作用加强，与对照组相比氯霉素处理组细胞密度显著下降(P＜0.05)，藻液发白。镜检氯霉素浓度≥10μg•mL－1时，栅藻、斜生栅藻和爪哇栅藻中均有一些细胞已经死亡;栅藻培养液中出现细胞变小的现象。

2.1.2液体培养6种微藻对硫酸新霉素的敏感性由图2a、b、c可知，在所选抗生素浓度范围内，3种真眼点藻对硫酸新霉素都不敏感。对于3种绿藻来说，不同浓度硫酸新霉素对其生长有不同的效应(图2d，e，f)。浓度10～100μg•mL－1硫酸新霉素对栅藻生长有显著促进作用(P＜0.05)，50μg•mL－1硫酸新霉素刺激效应最明显，细胞密度高达7.8×106•mL－1，比对照组提高了70%;而200μg•mL－1硫酸新霉素对栅藻生长有显著抑制效应(P＜0.05)，镜检该浓度处理组细胞多为畸形分裂细胞(其它组未见此现象)，可见高浓度硫酸新霉素抑制了栅藻细胞分裂繁殖。10～100μg•mL－1硫酸新霉素对斜生栅藻的生长没有明显作用(P＞0.05)，其生长曲线与对照组几乎重合;200μg•mL－1的硫酸新霉素使斜生栅藻的生长受到明显的抑制，细胞密度明显低于对照组(P＜0.05)，显微观察藻细胞已大量死亡。低浓度(10μg•mL－1)硫酸新霉素能促进爪哇栅藻生长，细胞密度是对照组的1.5倍，高浓度(200μg•mL－1)抑制生长，且差异性显著(P＜0.05)。

2.2固体培养6种微藻对2种抗生素的敏感性

2.2.1固体培养6种微藻对氯霉素的敏感性通过比较6种微藻在氯霉素固体培养基中的藻落数目，可以看出斜生栅藻对氯霉素最敏感(表2)。氯霉素浓度为20μg•mL－1时，斜生栅藻培养13d后有零星藻落长出，说明该浓度氯霉素对斜生栅藻生长有明显的抑制作用，但未能完全抑制其生长;氯霉素浓度为50μg•mL－1则完全抑制其生长，培养3w后，仍未有藻落出现。栅藻、爪哇栅藻、点状魏氏藻和魏氏真眼点藻对氯霉素较为敏感，20μg•mL－1氯霉素对这4种藻株生长有一定的抑制作用，浓度50μg•mL－1即达到致死剂量。波氏真眼点藻对氯霉素敏感性最差，50μg•mL－1氯霉素不能抑制藻细胞生长，100μg•mL－1才表现出一定的抑制作用。

3讨论

藻细胞固体平板培养法可以直观地反映微藻在不同剂量抗生素固体培养基中能否生长存活，方法简便，但只能定性而不能定量反映抗生素对微藻生长的作用过程。藻液细胞计数法根据细胞密度绘制藻生长曲线，能具体地反映微藻在抗生素的作用下生长状况，但工作量较大。本文结合了上述两种方法，研究了6种微藻对2种抗生素的敏感性，结果表明实验藻株在固体和液体培养基中的生长受抗生素的影响存在一定差异，这与李杰等［11］在研究固、液体培养条件下转基因盐藻对G418和氯霉素的敏感性不同的结论相似。这种差异的产生可能与固体、液体培养基中藻细胞数量、微藻在不同培养基中生长状况和抗生素在不同培养基中作用效果不同有关。因此，液体培养条件下适合的抗生素筛选浓度不能直接用于固体培养。本研究分别选取了真眼点藻门(魏氏真眼点藻、点状魏氏藻、波氏真眼点藻)和绿藻门(栅藻、斜生栅藻、爪哇栅藻)的6个藻种作为研究对象，分析了氯霉素和硫酸新霉素对这些藻种生长状况的影响。结果表明3种真眼点藻和3种绿藻对抗生素的敏感性差别较大，产生这种差异性的原因可能是:(1)真眼点藻门和绿藻门的细胞壁结构不同。周文礼等［12］研究了青霉素对金藻(Isochrysisgalbanastrain8701)、小球藻(Chlorellavulgaris)和小新月菱形藻(Nitzschiaclosterium.)的影响，认为这三种微藻细胞结构上的差异可能是微藻敏感性差异的根本原因;(2)与藻共存的菌不同。抗生素通过抑制细菌、霉菌等的生长间接引起不同微藻间生长的差异。氯霉素是抗生素抗性筛选中常用的一种抗生素，主要是通过干扰细胞核糖体的蛋白质合成，从而抑制细胞生长并最终导致死亡［13］。Smith－JohannsenH［14］等研究氯霉素对舞赭球藻(Ochromonasdanica)的细胞器超微结构的影响，发现在氯霉素的作用下，线粒体嵴的数量减少，导致ATP产量下降，进一步引起生长速率降低。有研究表明［15］，氯霉素主要是通过引起光和作用速率下降，以及有关蛋白(藻红藻蓝蛋白和可溶性蛋白)合成下降，从而对细胞生长产生影响。冉艳［16］等研究了氯霉素对拟南芥STN7和STN8基因表达的影响，发现氯霉素处理组，叶绿体蛋白合成受抑制，核基因STN7表达下调，STN8表达上调。HongTL等［17］报道氯霉素对蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)和周氏四爿藻(Tetraselmischui)生长均有抑制作用。唐颖等［18］研究显示氯霉素对盐藻的生长影响较大。本研究结果表明氯霉素对3种绿藻的抑制作用明显，与前人的研究报道一致。因此，可利用氯霉素抗性筛选技术对这3种绿藻突变株进行抗性筛选。但有关氯霉素对微藻作用机理有待于进一步研究。液体培养时，氯霉素在很大的浓度范围内对真眼点藻的生长没有明显的抑制作用，表明氯霉素可用于其无菌培养;固体培养时，点状魏氏藻、波氏真眼点藻和魏氏真眼点藻氯霉素致死剂量分别为50μg•mL－1、150μg•mL－1、50μg•mL－1，国内外至今未有抗生素对这3种真眼点藻生长影响的报道，因此本研究对今后真眼点藻的研究具有较大的参考价值。硫酸新霉素是一种氨基糖甙类抗生素，其主要作用机制是与核糖体30s亚基结合，抑制蛋白质的合成，硫酸新霉素进入细胞后主要堆积于线粒体和溶酶体中，破坏线粒体膜功能和使溶酶体膜破裂，抑制细胞生长并最终导致死亡［19］。CaJX［20］等研究了6种抗生素和1种除草剂对顿顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)的敏感性，发现其对硫酸新霉素具有较高的耐受性。本研究发现液体培养时3种真眼点藻对硫酸新霉素不敏感。大多数抗生素高浓度对微藻生长起抑制作用，而一些抗生素在低浓度时对藻细胞的生长有一定的促进作用。本研究发现低剂量硫酸新霉素能促进栅藻和爪哇栅藻的生长，高剂量能抑制其生长，产生这种现象的原因可能是低浓度毒物刺激效应(Hormesis)。已有研究表明除草剂［21］和抗生素［22，23］等存在低浓度毒物刺激效应，针对低浓度毒物刺激效应机理，有多种理论，但均缺乏足够的实验证据支撑。产生这种现象的原因可能是:(1)抗生素对藻类的直接作用，一方面抗生素可能作为毒物抑制藻类的生长，另一方面也可能在特定浓度范围内促进细胞内活性氧的增加，使微藻的生理、生化成分发生改变，促进微藻的生长［24］;(2)藻菌间既存在着互利关系，也存在拮抗关系，抗生素可能通过抑制与藻共存的菌生长，间接对微藻产生影响［25］。StebbingARD［26］认为这个效应只有适当的实验设计中才能观察到，这就解释了为什么在试验浓度范围内，没有观察到氯霉素促进微藻生长。由于毒物刺激效应的存在，在微藻培养过程中便可以考虑加入适量的抗生素，除菌同时提高生物量，至于这是否会对微藻其它生物学特性产生影响还有待于进一步的研究。综合液体和固体培养的实验结果来看，3种绿藻对氯霉素都表现出高度敏感性。在固体培养中，50μg•mL－1氯霉素即可完全抑制绿藻的生长;而在液体培养中，当用量达10μg•mL－1时，即可明显抑制其生长。因此，氯霉素适宜做3种绿藻突变株抗性筛选剂。对于3种真眼点藻(点状魏氏藻、波氏真眼点藻、魏氏真眼点藻)而言，在固体培养中，氯霉素可作为其突变株抗性筛选剂，筛选浓度分别为50μg•mL－1、150μg•mL－1、50μg•mL－1。