电针治疗对老年人阳虚免疫调节的影响

本文作者：王华 毛慧芳 刘建民 郝青 唐宏图 李佳 单位：湖北中医药大学针灸骨伤学院

中医证候理论高度概括不同疾病所存在的相同病理状态特点，使临床治疗实现执繁就简的效果。阳虚证是中医临床常见的证候之一，是机体组织器官功能减退、机体反应性降低、代谢活动减弱、热量不足的病理状态。大量的资料显示，阳虚证是临床多数老年疾病（如老年痴呆症、高血压病、糖尿病、肾病综合征等）的重要症候之一［1－4］，因此，开展老年阳虚证治疗研究，将为临床诸多老年疾病治疗带来契机。我们已在探索电针调控免疫对老年机体衰老状态的干预效应方面取得了初步成果［5－6］。本实验以D－半乳糖和氢化可的松致衰老阳虚模型大鼠为研究对象，进一步探讨电针对老年模型大鼠免疫细胞凋亡的相关影响，为电针调控免疫解决衰老相关问题提供一定的实验依据。

1材料与方法

1．1主要仪器与试剂7900HT荧光定量PCR仪（美国ABI）；5417R高速冷冻离心机（德国Eppendorf）；KDC－160H型电泳槽（上海）；ND1000核酸测定仪（美国nano－drop）。Lympholyte－Rat淋巴细胞分离液（CL5041，Cedarlane，上海普飞提供）；基因表达检测所需试剂均由北京天根生物公司提供。

1．2实验动物与分组实验动物为5月龄SpragueDawley健康雌性大鼠，30只，清洁级，体质量（180±20）g，购自华中科技大学同济医学院实验动物学部，许可证号：SCXK（鄂）2004－0007。所有动物饲养于温度（18～25℃）和湿度（45％～55％）较为恒定的动物饲养室，可以自由摄食和饮水。根据简单随机排序法将动物分为正常对照组、老年阳虚模型组、“双固一通”电针组，每组各10只。

1．3衰老阳虚模型制作［7］大鼠适应性喂养1周后开始造模。除正常对照组外，其余各组按每鼠每日125mg／kg给予D－半乳糖颈背部皮下注射连续40d，之后再行后腿肌肉注射氢化可的松1．5mg／100g，连续7d；正常对照组大鼠每日皮下注射等量生理盐水1次，连续47d。造模成功后的大鼠出现拱背蜷曲、肢尾冷、挤卧一起、被毛失去光泽、足趾浮肿、神疲、少食、反应迟钝、小便多等虚损症状。根据中医阳虚证辨证参考标准［8］，类似阳虚状态。

1．4各组处理方法正常对照组正常饲养，不进行造模及电针治疗。老年阳虚模型组造模，不予电针治疗。“双固一通”电针组造模成功后，参照华兴邦等制定的《实验动物穴位图谱》取“关元”“后三里”和“百会”穴，穴区剪毛备皮，75％医用乙醇常规消毒，用华佗牌0．35mm×25mm不锈钢毫针针刺。“关元”直刺3～5mm，双侧“后三里”直刺3～5mm，“百会”向后方平刺5mm。“关元”与“后三里”接通HANSLH202H型电针仪，双侧“后三里”与“关元”隔日交替接1对电极，选用连续波，频率2Hz，强度1mA，通电15min。每日上午9：00～11：00治疗1次，每周6次，共治疗4周。正常对照组与老年阳虚模型组大鼠与电针治疗组相同方法、相同时间段内抓取固定。各组大鼠治疗结束后，禁食，于第2天取材，进行相应指标检测。

1．5标本采集各组大鼠用20％乌拉坦（5mL／kg）腹腔注射麻醉，断颈处死，立即无菌取脾脏；采用Lympholyte－Rat试剂，按试剂盒说明书在超净台上分离脾脏淋巴细胞；用抗CD3抗体诱导4h；PBS液洗涤2遍，收集脾脏淋巴细胞［9］。

1．6指标检测方法实时荧光定量法（RT－PCR）检测脾脏淋巴细胞中Fas、Bcl－2和Bax基因的表达：每个标本取1×107个淋巴细胞总RNA提取试剂盒（TRizol法）进行RNA提取，用核酸测定仪检测RNA的纯度和浓度。取总RNA3μg进行反转录。采用反转录二步法：①模板总RNA3μg，Oligo（dT）18primer1μL，补DEPC水至12μL；混匀后离心；65℃5min，迅速冰上冷却1min。②5×RTbuffer4μL，10mmol／LdNTP2μL，RnaseInhibitor1μL，RTranscriptase1μL，补DEPC水使反应总体积为20μL。反应条件：42℃60min，70℃5min终止反应。cDNA置－20℃保存备用。根据GenBank中相应的序列，以PrimerPremier5．0软件设计引物，由大连宝生物TaKaRa公司合成，序列如表1。PCR反应体系中含2×SYBRPremix12μL，上、下游引物各1μL，模板cDNA1μL，ddH2O9μL，PCR总体系24μL（做两个复孔）。PCR反应的条件：95℃10min；95℃15s，58℃1min，共40个循环。分析溶解曲线和琼脂糖电泳PCR产物，验证引物的特异性。结果判断：目的基因阳性表达的荧光定量扩增曲线呈S形，电泳图可见特异性条带；阴性对照样品则呈不规则波浪线，无特异性条带。建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r＝0．999），Ct值反映了模板扩增到一定量拷贝数时（处于指数上升期）所需反应循环数大小。Ct值越大，参与反应的起始模板量就越小，反之则越大。样品中Ct均值＜30表示为目的基因阳性，以2－Ct表示样品中目的基因mRNA相对表达量。Ct＝样本Ct均值－内参Ct均值，Ct＝Ct－（随机阴性对照样品Ct均值－该样品内参Ct均值）。

1．7统计学处理所有实验数据用均值±标准差（x珚±s）表示，使用SPSS13．0软件进行统计学处理，采用方差齐性检验和单因素方差分析，组间比较采用q检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1PCR反应特异性将实时荧光定量PCR的扩增产物分别取5μL经15g／L琼脂糖凝胶电泳，结果显示Fas、Bax和Bcl－2基因扩增产物片段分别为279bp、297bp、414bp，β－actin扩增产物片段为206bp，各产物片段分子量大小与理论预期值一致。

2．2FasmRNA在各组大鼠脾脏中的表达各组大鼠脾淋巴细胞FasmRNA均呈阳性表达，如图1所示。老年阳虚模型组促凋亡基因FasmRNA［（1．261±0．021）％］的表达高于正常对照组［（0．897±0．030）％］（P＜0．01），“双固一通”电针组FasmRNA［（1．052±0．016）％］与模型组比较显著降低（P＜0．01）。

2．3BaxmRNA在各组大鼠脾脏中的表达各组大鼠脾淋巴细胞BaxmRNA均呈阳性表达，如图2所示。老年阳虚模型组促凋亡基因BaxmRNA［（1．464±0．015）％］的表达高于正常对照组［（0．923±0．042）％］（P＜0．01），“双固一通”电针组BaxmRNA［（1．126±0．025）％］与模型组比较显著降低（P＜0．01）。2．4Bcl－2mRNA在各组大鼠脾脏中的表达各组大鼠脾淋巴细胞Bcl－2mRNA均呈阳性表达，如图3所示。老年阳虚模型组抗凋亡基因Bcl－2mRNA［（0．547±0．011）％］的表达明显低于正常对照组［（0．781±0．022）％］（P＜0．01），“双固一通”电针组Bcl－2mRNA［（0．639±0．018）％］明显高于模型组（P＜0．05）.

3讨论

近年来从分子与基因水平上提出的细胞凋亡学说已成为人们研究衰老机制的热门学说之一，探讨老年阳虚机体淋巴细胞过度凋亡的调控基因表达模式具有一定价值。老龄肾阳虚证的发生涉及一系列与细胞周期、凋亡、肿瘤发生与抑制相关的免疫紊乱过程，推测其可能与个体的衰老存在密切关系［10］。研究表明，阳虚机体伴随着免疫功能下降，脾脏淋巴细胞凋亡能力的高低可直接反映机体免疫功能的强弱［11］。Fas是肿瘤坏死因子超家族的成员，具有介导细胞凋亡的作用，称为死亡受体。FasL为其配体，称为死亡因子。Bcl－2具有抑制细胞凋亡、延长细胞生存期的作用，被称为长寿基因。Bax基因属于Bcl－2基因家族，对Bcl－2产生阻抑作用，Bax是极重要的促细胞凋亡基因之一。淋巴细胞凋亡受Fas／FasL系统、Bcl－2家族及细胞因子等调控，且Fas／FasL系统具有使细胞凋亡和存活的双重功能。Fas／FasL在免疫细胞上的表达相对较高，其介导的细胞凋亡在淋巴细胞的发育和调节中发挥重要作用［12］。淋巴细胞可能未通过自身的Fas直接参与细胞凋亡，但可能通过释放细胞因子间接上调Fas／FasL的表达［13］。Bcl－2家族蛋白的相互作用决定了细胞的生死，老年人CD4＋和CD8＋T细胞Bax的表达增加，Bcl－2的表达下降，抗凋亡基因表达水平降低，促凋亡基因表达增高［14］。本实验结果显示，老年阳虚模型大鼠脾脏促凋亡的Fas、Bax基因mRNA阳性表达上调，抗凋亡Bcl－2基因mRNA阳性表达下调，这与陈瑜等［15］关于老年大鼠T细胞凋亡特有的基因表达模式研究结果一致。中医学认为，肾气亏虚和脾胃虚弱是机体衰老的主要原因。本实验选择双固强壮穴“关元”“足三里”和一通辨证用穴“百会”作为施治主穴，是基于笔者“双固一通”针法［16］而来，有关“关元”“足三里”“百会”穴防治阳虚衰老的研究已多见报道［17－19］。课题组前期工作表明，采用“双固一通”配穴原则对阳虚证表现出明显的免疫功能调节作用［20］。本研究结果表明，“双固一通”电针法能明显下调老年阳虚大鼠淋巴细胞促凋亡基因Fas、BaxmRNA表达，上调抗凋亡基因Bcl－2mRNA表达，提示“双固一通”电针法对老年阳虚证模型大鼠过度的淋巴细胞凋亡具有干预疗效，可能是电针重建淋巴细胞凋亡、恢复免疫稳态、延缓免疫衰老的重要分子生物学机制，这与赵果毅采用艾灸调控衰老模型大鼠海马神经元凋亡蛋白Bcl－2和Bax的表达结果相一致［21］。