毛细管气相色谱法测定糜蛋白酶中残留有机溶剂

【摘要】 目的 建立测定糜蛋白酶中有机溶剂丙酮残留量的方法。方法 采用毛细管气相色谱法,色谱柱为Supelco 25301-U型石英毛细管柱，检测器为氢火焰离子化检测器，载气为高纯度氮气，水为溶解介质，检测了糜蛋白酶中丙酮的残留量。结果 丙酮在样品中达到完全分离,在1．59~25．50 ppm浓度范围内具有良好的线性,线性方程为A=306．0C+184．3，r=0．999 5，检测限为0．03 ppm,方法回收率为99．9％，RSD 为1．7%。结论 本法能快速准确的检测糜蛋白酶中有机溶剂丙酮残留量,可用于糜蛋白酶质量控制中的有机残留溶剂检查。

【关键词】气相色谱法;糜蛋白酶;有机溶剂残留量

Determination of acetone residue in chymotrypsin by capillary gas chromatography

MIN Guang-qing.

Deyang Sinozyme Pharmaceutical Co.,Ltd Sichuan，Deyang，618304，China

【Abstract】 Objective To establish a method for determination acetone residue in chymotrypsin.Methods A capillary gas chromatography method was adopted：the column was Supelco 25301-U quartz capillary column,detector was FID,the carrier gas was Nitrogen gas.Water was solvent media.Results The linear range was 1．59-25．50 ppm(r=0．999 5)，with the average recovery 99．9%(RSD 1．7%)and detectability 0．03 ppm.Conclusion The acetone residue in chymotrypsincan be determined sensitively and acturely by capillary GC.

【Key words】Capillary GC; Chymotrypsin; Organic solvent

糜蛋白酶是从牛、猪胰脏中提取制得，糜蛋白酶在胰脏中以酶原(牛糜蛋白酶原A、B1或猪糜蛋白酶原A、B、C)的形式存在，通过激活，而形成相应的糜蛋白酶。糜蛋白酶具有蛋白水解作用，主要水解由芳香族氨基酸，如苯丙氨酸、酪氨酸等的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键，糜蛋白酶具有抗炎、扩张血管、水解蛋白质等作用。临床上主要用于各种感染及炎症的辅助治疗,如颅内感染性炎症、呼吸系统、消化系统的感染及炎症，以及治疗毒蛇咬伤、黄蜂螫伤、蜈蚣咬伤等。

由于糜蛋白酶精制过程中，采用丙酮进行重结晶，因此需对丙酮的残留量进行检测。本研究用毛细管气相色谱法测定了糜蛋白酶中丙酮的残留量,方法准确可靠。

1 仪器和试剂

色谱仪：GC-7900 气相色谱仪(上海天美)，FA1004型电子天平(成都方舟科技开发公司)。试剂：色谱纯丙酮、双蒸水。

试药：糜蛋白酶中试产品三批(德阳新诺赛制药有限公司，批号分别为D050301、D050302、D050303)。

2 方法与结果

2．1 色谱条件 色谱柱：Supelco 25301-U型石英毛细管柱，30 m×0．53 mm，1 μ Film；检测器：FID；载气为高纯度氮气；进样口及检测器温度均为200℃，柱温50℃，柱前压5．7Psi，分流比50∶1，进样量1 μl。

2．2 对照品溶液的配制 精密量取丙酮0．2 ml,置100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；精密量取0．4 ml，置100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得每1 ml含丙酮6．376×10-6 mg即6．376 ppm(丙酮的密度为0．797 mg/ml,1 ppm=1 μg/L)的对照品溶液。

2．3 供试品溶液的配制 取本品(批号分别为D050301、D050302、D050303)各约0．5 g，精密称定，置10 ml量瓶中，加水稀释至刻度，振摇使溶解，即得供试品溶液。

2．4 系统适应性试验 精密量取溶剂水、丙酮对照品溶液、供试品溶液各1 μl,注入色谱仪，记录色谱图。结果溶剂不干扰丙酮的测定，供试品溶液除溶剂峰以外，无丙酮峰及其他杂质峰出现，不干扰丙酮的测定。对照品溶液主峰分离度为2．728,理论塔板数为13518,可用于测定，色谱图见图1。

2．5 标准曲线的制备 精密量取丙酮0．2 ml，置100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀,得浓度为1．594×10-3mg/ml对照品贮备液，即1 594 ppm的对照品贮备液，精密量取贮备液1．6、1．2、0．8、0．4、0．2、0．1 ml,置100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，得系列浓度的对照品溶液，分别进样1 μl,记录色谱图。结果见表1。

以峰面积A为纵坐标，浓度C(ppm)为横坐标，作图并进行线性回归，得回归方程及回归系数分别为：A=306．0C+184．3,r=0．999 5

以上结果表明，丙酮在1．59~25．50 ppm范围内线性良好，可用于测定。

2．6 重现性试验 按“2．2”项下的中间浓度溶液配制6 份溶液，分别取1μl,按“2．1”项下色谱条件进样测定,记录色谱,并按外标法计算平均含量，结果丙酮含量的相对标准差(RSD)为0．65%。

2．7 检测限 将以上对照液逐渐稀释进样，当S/N约为3时，记录色谱图，见图1，计算检测限，结果丙酮检测限为0．3 ppm。

2．8 回收率试验 取对照品贮备液2．0 ml加水稀释至50 ml，分别取1．2、1．0、0．8 ml各3份，分别置已加入本品约0．5 g 的10 ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，依法分别进样1 μl，记录其色谱图及峰面积。以外标法计算丙酮的测得量及回收率，结果见表2。

由表2可知试验结果表明，用本法测定本品中丙酮的残留量，其方法回收率良好，相对标准偏差较小，符合要求。

2．9 三批中试样品有机残留量的测定 分别取三批供试品溶液注入色谱柱，记录色谱峰，计算样品中有机残留量。结果三批样品丙酮残留量均低于检测限。

3 讨论

3．1 由于糜蛋白酶精制过程中，采用丙酮进行重结晶，因此需对丙酮的残留量进行检查。由于糜蛋白酶和丙酮均在水中溶解性较好，所以采用水为溶剂。

3．3 毛细管长度对分离度有较大影响，在实验初期曾采用15 m毛细管柱，结果分离效果较差，采用30 m柱后才达到了满意的效果。

3．2 本方法简便快捷，灵敏度、分离度和回收率均能满足要求。故本方法适用于糜蛋白酶中有机溶剂丙酮的检测。

参考文献

1 田智慧，王连尧，李守申，等.毛细管气相色谱法测定氨曲南中4种有机溶剂残留量.中国药学杂志，2006，41(16)：1272-1273.

2 国家药典委员会.中国药典(二部).化学工业出版社，2005：64.