整合素α3在髓母细胞瘤干细胞中的表达及对侵袭作用的影响

【摘要】 目的 研究整合素α3在髓母细胞瘤干细胞中的表达及其对侵袭作用的影响。方法 应用免疫磁珠法（MACS）从髓母细胞瘤标本中获得CD133+和CD133-细胞， 通过免疫组化和实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测CD133+ 和CD133-两组细胞中整合素α3的表达， 运用transwell细胞侵袭实验观察使用整合素α3抗体和未使用整合素抗体对CD133+侵袭作用的影响。结果 整合素α3在CD133+组的表达显著高于CD133-组（P

【关键词】 髓母细胞瘤；干细胞；整合素α3；侵袭

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2016.30.013

【Abstract】 Objective To research expression of integrin α3 in medulloblastoma stem cells and its influence on invasion effect. Methods Magnetic activated cell sorting （MACS） was applied to taken CD133+ and CD133- cells from medulloblastoma samples. Immunohistochemistry and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction （PCR） were used to detect expression of integrin α3 in CD133+ and CD133- cells. Influence by application of integrin α3 antibody on CD133+ invasion effect was observed by transwell cell invasion assay. Results Expression of integrin α3 in CD133+ group was obviously higher than that in CD133- group （P

【Key words】 Medulloblastoma； Stem cells； Integrin α3； Invasion

髓母细胞瘤是儿童最常见的脑恶性肿瘤， 容易复发， 同时易沿蛛网膜下腔播散转移。肿瘤细胞的侵袭性生长是一个多步骤的复杂过程， 有多种生物化学因子参与其中[1， 2]。本研究通过检测髓母细胞瘤干细胞中整合素α3的表达， 同时应用抗整合素单克隆抗体， 观察其对侵袭作用的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料 髓母细胞瘤干细胞取自2013年～2015年河南省人民医院神经外科手术标本。

1. 2 方法

1. 2. 1 髓母细胞瘤干细胞的培养和鉴定 肿瘤手术标本剪碎后胰蛋白酶消化， 吹打成单细胞悬液；过滤、离心收集细胞， 培养于神经干细胞培养液中（含Neurobasal培养基、1：50 B27添加剂、20 μg/L成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮细胞生长因子）， 在37℃、 5%CO2细胞培养箱中培养， 培养所得细胞呈神经球状生长。

1. 2. 2 免疫磁珠法分选CD133+和CD133-细胞 使用免疫磁珠细胞分选试剂盒（Mihenyi Biotech公司）分离出CD133+和CD133-细胞， 并使用流式细胞分析仪进行纯度测定。

1. 2. 3 逆转录定量PCR（QRT-PCR）检测 QRT-PCR检测分选后 CD133+细胞、CD133-细胞中整合素α3的表达， 上游引物5'-GGAAGGAACAAAGACAGGCAAAC-3'， 下游引物5'-GGTA GTGGTGAGTGAGAAGTGGC-3'。

1. 2. 4 免疫组化 本实验采用免疫组化法， 整合素α3多克隆抗体购自武汉博士德公司， 工作浓度为1：100。

1. 2. 5 侵袭实验 将CD133+细胞分为两组进行侵袭实验， 一组加入抗整合素α3单克隆抗体（购自武汉博士德公司）， 浓度为100 μg/ml；另一组为空白对照组。将Transwell小室加在24孔板上， 上室进行铺胶， 每孔加入100 μl（每孔约含2×104 个细胞）无血清的细胞悬液， 下室加入500 μl含10% 胎牛血清的DMEM， 种板后置于培养箱培养24 h后， 取出上室， 弃掉上室中培养基， 多聚甲醛溶液固定， 结晶紫染色。倒置显微镜观察， 拍照计数。

1. 3 观察指标 观察CD133+ 和CD133-两组中整合素α3的表达、每个视野穿过小室聚碳酸酯膜的平均细胞数目。

1. 4 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P

2 结果

2. 1 CD133+ 和CD133-两组中整合素α3的表达 QRT-PCR 检测结果显示， CD133+ 和CD133-两组中整合素α3mRNA相对表达量分别为（3.985±0.236）、（0.047±0.003）， 比较差异具有统计学意义（P

2. 2 抗整合素单克隆抗体应用后对髓母细胞瘤干细胞侵袭能力的影响 Transwell侵袭实验结果显示， 使用整合素α3单克隆抗体组与空白对照组相比， 干细胞侵袭能力下降， 每个视野穿过小室聚碳酸酯膜的平均细胞数目显著降低， 两组的细胞数目分别为（26.53±3.71）、（54.76±6.27）， 比较差异有统计学意义（P

3 讨论

近年来， 越来越多的证据支持肿瘤干细胞学说， 并认为肿瘤干细胞在肿瘤的发生、转移、复发和对治疗的抵抗中发挥着重要作用。干细胞特征的维持与干细胞所处的微环境（Niche， 壁龛）有密切关系。干细胞与基底膜的粘附是干细胞维持其特性的基本条件。干细胞通过各种粘附分子介导与细胞外基质之间的粘附， 从而使干细胞定居于壁龛中。整合素作为一类重要的细胞表面受体， 是重要的粘附分子之一。干细胞主要通过表达整合素实现对基底膜各种成分的粘附。干细胞对基底膜的脱粘附是诱导干细胞脱离干细胞群进入分化周期的重要调控机制。

整合素在多种恶性肿瘤中的表达明显高于周围的癌旁组织， 并且与预后明显负相关， 说明它在肿瘤的侵袭转移中起着重要作用。但关于其在干细胞中的表达报道较少。本研究通过免疫磁珠法分选出CD133+的干细胞和CD133-的细胞。然后应用免疫组化和QRT-PCR检测两组整合素α3的表达情况， 发现CD133+组明显高于 CD133-组（P

神经干细胞一个重要特征是它们聚集在血管周围的壁龛内。本研究证实了上述结论， 镜下发现整合素阳性的干细胞主要聚居在血管周围。Lathia等[3]还发现60%表达整合素α6的胶质母细胞瘤细胞位于血管5 μm以内。并且通过免疫组化双染发现整合素和CD133+在血管周围区域联合表达。

正常情况下， 干细胞寄居在组织或器官特定的壁龛中， 破坏肿瘤干细胞居住的壁龛可以消灭肿瘤干细胞[4]。在本实验应用抗整合素单克隆抗体使粘附于基底膜的肿瘤干细胞脱离， 从而破坏了干细胞的壁龛。通过Transwell实验发现， 与对照组相比， 穿膜细胞数减少， 细胞的侵袭活动能力下降。

综上所述， 整合素在髓母细胞瘤干细胞中的高表达， 以及通过抗整合素单克隆抗体破坏肿瘤干细胞的壁龛， 可使干细胞侵袭能力下降。整合素可作为将来治疗髓母细胞瘤的一个方向。

参考文献

[1] 王勇， 梁庆华， 史锡文. uPA和FAK在髓母细胞瘤中的表达及临床意义.中国实用医药， 2012， 7（20）：40-42.

[2] 王勇， 毛伯镛， 程宏伟， 等. uPA和KDR在髓母细胞瘤中的表达及意义.中华神经外科杂志， 2003， 19（2）：106-108.

[3] Lathia JD， Gallagher J， Heddleston JM， et al. Integrin alpha 6 regulates glioblastoma stem cells. Cell Stem Cell， 2010， 6（5）：421-432.

[4] Nakada M， Nambu E， Furuyama N， et al. Integrin α3 is overexpressed in glioma stem-like cells and promotes invasion. Br J Cancer， 2013， 108（12）：2516-2524.

[收稿日期：2016-10-25]