血清微环境对小鼠T细胞衰老的调节作用

[摘要]目的：探讨血清微环境对小鼠T细胞衰老的调节作用。方法：分别取年老（12～14月龄）及年轻（1.5～2月龄）小鼠各10只，提取其脾脏淋巴细胞及血清，实验分4组。组I为年老鼠T淋巴细胞+10%年轻鼠血清；组II为年老鼠T淋巴细胞+10%年老鼠血清；组III为年轻鼠T淋巴细胞+10%年轻鼠血清；组IV为年轻鼠T淋巴细胞+10%年老鼠血清。培养48h后，经流式细胞术研究CD8+CD28+共表达率差异。结果：组I和组II T细胞表面的CD8+CD28+共表达率分别是（10.84±0.6841）%和（3.18±0.1789）%，组III和组IV T细胞表面的CD8+CD28+共表达分别是（12.5±0.9445）%和（8.36±0.2074）%。各组间对比有统计学差异（P

[关键词]血清微环境；T淋巴细胞；免疫衰老；流式细胞术

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）06-0946-03

Effects of serum microenvironment on CD8+CD28+T cell

(SHI Bing-bing1,ZHANG Lei1,ZHOU Bi-yu2,CAO Yi-mei2,GAO Feng2,YIN Ning-bei2,YAN Li1, ZHAO Zhen-ming2

（1.Research center,2.The First Department, Plastic Surgery Hospital，Chinese Academic Medical Science and Peking Union Medical College，Beijing 100144，China)

Abstract： ObjectiveTo observe the effects of serum microenvironment on CD8+CD28+T cells. MethodsMouse lymphocytes were isolated from spleen,these cells from young mouse and old mouse were cultured under the following serum microenvironment. All mouse were divided into four groups: the lymphocytes from old mouse cultured with young serum (group I);the lymphocytes from old mouse cultured with old serum (group II),the lymphocytes from young mouse cultured with young serum (group III)，and the lymphocytes from young mouse cultured with old serum (group IV).The co-expression of CD8+CD28+ on T cells was detected by the flow cytometry.ResultsIn the group of lymphocytes from old mouse cultured with young serum, the co-expression of CD8+CD28+ was （10.84±0.6841）%. In the group of lymphocytes from old mouse cultured with old serum group.The co-expression of CD8+CD28+ was （3.18±0.1789）%. In the group of lymphocytes from young mouse cultured with young serum and cultured with old serum group,the co-expression of CD8+CD28+ were （12.5±0.9445 ）%and （8.36±0.2074）% , respectively. There were significant statistical differences in these four groups.ConclusionOur study revealed that young serum could improve the co-expression of CD8+CD28+ on T cells. So the senescence of T cells can be regulated by serum.

Key words:serum microenvironment；T lymphocytes；immunosenescence；flow cytometry

衰老导致的皮肤及容颜的改变是整形美容外科的难题，其本质是随着年龄增长而出现的缓慢进行的生物体细胞、组织、器官形态结构和功能的退行性变化。而免疫衰老又是机体衰老的重要机制之一，它参与了机体其他系统衰老的发生过程。免疫衰老的机制尚不完全清楚，部分学者认为免疫衰老与胸腺退化导致的T细胞衰老有关。而T细胞衰老的一项重要指标是CD8+CD28+ 共表达率降低[1]。

血清微环境，广泛参与细胞之间的相互作用，调节细胞的功能[2]。有学者研究表明血清中含有能够调控细胞衰老的相关因素，这其中包括：细胞外基质成分，氧张力，生长因子，细胞因子，以及血清的pH值、离子浓度（如钙离子浓度）等。甚至代谢产物如精氨酸酶也起作用[3]。目前少有血清微环境对小鼠T细胞衰老的调节作用的研究[4-5]，本实验旨在研究血清微环境对T细胞表面的CD8+CD28+共表达的影响情况，从而探讨血清微环境对免疫老化的调节作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物：C57BL/6N小鼠（购自北京维通利华公司），年老组：12～14月龄，10只（相当于人类生理年龄40～50岁），雌性， 体重30g。年轻组：1.5～2月龄，10只（相当于人类生理年龄15～20岁），雌性， 体重20g。以上动物均为SPF级。

1.2 仪器、试剂：CO2细胞培养孵箱（日本Hirasawa Works 公司）、Biofuge离心机（德国Heraeus公司）、Transwell培养皿（美国corning公司）、FACS Aria流式细胞仪（美国BD公司）、小鼠淋巴分离液（中国医学科学院生物工程研究所）、RPMI1640培养基（美国Hyclone公司）、DMEM/F12培养基（美国Hyclone公司）、特级胎牛血清（美国Gibco公司）、PE-anti-mouse CD8a（美国biolegend公司）、FITC-anti-m ouse CD28（美国biolegend公司）、200目细胞筛、10ml玻璃注射器。

1.3 方法

1.3.1 血清的制备：血清购自于北京中国军事医学科学院，无菌操作下，分别自月龄1.5～2月及月龄12～14月C57BL/6N雌性小鼠心脏内取血，自然沉淀4℃过夜，离心1000rpm/min，5min，提取上清液备用。

1.3.2 小鼠淋巴细胞悬浮液制备：以10%水合氯醛0.02ml腹腔注射，麻醉小鼠，75%酒精浸泡10min,无菌操作下剪开左下腹部皮肤进入腹腔，取出脾脏，PBS冲洗两遍，放到200目细胞筛上用10ml玻璃注射器内芯进行研磨，研磨后用RPMI1640培养基冲洗两遍，放入5ml小鼠淋巴细胞分离液中，2 500rpm、20min慢加速慢减速离心，吸取第二层白色浑浊层，均加入含有15%胎牛血清的RPMI1640培养基10ml，细胞计数后备用。

1.3.3 分组和处理：① 年老鼠T淋巴细胞组：组I：年老鼠T淋巴细胞+10%年轻鼠血清溶液；②年老鼠T淋巴细胞组：组II：年老鼠T淋巴细胞+10%年老鼠血清溶液；③年轻鼠T淋巴细胞组：组III：年轻鼠T淋巴细胞+10%年轻鼠血清溶液；④ 年轻鼠T淋巴细胞组：组IV：年轻鼠T淋巴细胞+10%年老鼠血清溶液。

1.3.4 检测：以上各组在37℃、5% CO2细胞培养孵箱里培养48h后，吸出淋巴细胞，离心后加入100μl细胞染色缓冲液，并加入PE-anti-mouse CD8a和FITC-anti-mouse CD28，4℃孵育60min，细胞染色缓冲液冲洗两遍，用流式细胞仪检测。

1.3.5统计学方法：采用SPSS 13.0统计软件，所有数据用（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。P

2结果（表1、图1）

I组和II组对比结果显示：年轻血清在提高年老小鼠T细胞的CD8+CD28+共表达率方面比年老血清高。

I组和III 组对比结果显示：年轻血清分别加入年老小鼠T细胞和年轻小鼠T细胞，前者的CD8+CD28+共表达率低于后者的CD8+CD28+共表达率。

III组和IV组对比结果显示：年老血清能使年轻鼠的CD8+CD28+共表达率降低。

3讨论

脾脏中的免疫细胞主要由T细胞和B细胞组成。衰老的T细胞的一个重要变化是CD8+CD28+分子表达降低；同时在衰老个体中出现了较多的CD28-T细胞的亚群[6]。这是因为CD28是T细胞表面一个主要的共刺激分子，对T细胞介导的免疫应答和刺激T细胞增殖及细胞因子的产生具有重要的作用，是反映T细胞衰老的重要指标。已有研究表明，老年人T细胞表面的CD8+CD28+共表达率与年青人相比有显著降低[7]。笔者的研究也发现衰老小鼠的CD8+CD28+共表达比率低于年轻小鼠（另文发表）。所以，如果衰老鼠T细胞表面的CD8+CD28+共表达率升高，就可以认为T细胞变“年轻”了，T细胞的衰老发生了逆转[8]。本实验就是想通过研究血清微环境对T细胞表面标记CD8+CD28+的影响，为下一步免疫老化的研究打下基础。研究结果初步揭示，年轻血清微环境能够有效的提高衰老小鼠T细胞表面CD8+CD28+的共表达率。另一方面衰老血清微环境可以使年轻鼠的T细胞表面CD8+CD28+共表达率降低，使年轻的T细胞变“衰老”。综合以上结果，说明了血清微环境对小鼠T细胞的衰老具有调节作用的影响。同时I和III组对比还发现，虽然年轻的血清微环境可以使年老鼠T细胞变“年轻”，但是仍然低于年轻鼠T细胞的CD8+CD28+共表达率。所以说，血清微环境可能只是起部分的作用，并不能使衰老的T细胞发生完全逆转，具体机制还需进一步研究。

笔者认为，年轻的血清微环境之所以可以提高衰老鼠T细胞表面CD8+CD28+的表达率，可能与年轻的胸腺有关[9-10]，因为胸腺是T细胞发育、成熟的主要场所，并且它还是内分泌器官，能分泌如胸腺肽等多种活性物质进入血液[11]，从而改变血清成分，年轻的血清进一步可以改变T细胞的表面CD8+CD28+的表达；而衰老鼠由于胸腺发生脂肪化使衰老胸腺分泌的物质从量或质上发生改变[12-13]，从而出现衰老血清使年轻鼠的T细胞变“衰老”的现象[14]。

[参考文献]

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[收稿日期]2011-04-17 [修回日期]2011-05-23

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