内毒素血症Wistar大鼠血清TNF—α与心肌细胞凋亡的关系

[摘要] 目的 研究内毒素血症Wistar大鼠血清TNF-α与心肌细胞凋亡的关系及EPO对其的影响。 方法 将180只Wistar大鼠随机分为对照组、脂多糖LPS组及EPO处理组，分别在处理后2h、 4h、 6h、 12h、 24h断头取血并取其心脏。采用ELISA法测定血清TNF-α，用TUNEL法检测原位凋亡。 结果 ①LPS组TNF-α浓度在2h时达到最大值，且明显高于对照组（P0.05）。LPS+EPO组TNF-α浓度在2 h时达到最大值，且明显低于LPS组（P

[关键词] 内毒素血症；TNF-α；心肌细胞凋亡指数；EPO

[中图分类号] R541 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2014）02-0001-03

A study on the relationship between endotoxemia serum TNF-α of Wistar rats and apoptosis of myocardial cell

SUN Wei WANG Xiaoping JIN Wenyang

Emergency Department， Taizhou Hospital， Enze Medical Center of Taizhou in Zhejiang province，Taizhou 317000，China

[Abstract] Objective To study the relationship of rat serum TNF-α of endotoxin blood disease and the apoptosis of myocardial cells and EPO’s effects on it. Methods 180 Wistar rats were randomly divided into the control group， lipopolysaccharide LPS group and EPO treatment group. All the rats were respectively beheaded 2h， 4h， 6h， 12h and 24h after treatment for their blood samples and their levers were also taken out. Their TNF-α were tested by way of ELISA， and their in situ apoptosis were tested through the method of TUNEL. Results ①The TNF-α concentration of the LPS group reached its highest level in 2 hours， and it was obviously higher than that of the control group（P0.05）. The TNF-α concentration of LPS+EPO group reached its peak in 2 hours， and it was obviously lower than that of the LPS group （P

[Key words] Dndotoxin blood disease； TNF-α； Apoptosis index of myocardial cells； EPO

近年来研究证实，机体在遭遇感染时首先产生的、起核心作用的炎症介质是肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF），尤其是TNF-α。脂多糖（LPS）是引起感染性休克机体损伤的主要物质，可对机体形成广泛的影响及损伤，并引起心率减慢、心肌收缩力下降，严重影响心功能[1]。已有研究表明[2]，EPO对心脏有保护作用。目前TNF-α与内毒素血症心肌细胞凋亡之间关系未见系统报道，外源性EPO对心肌的保护机制尚不清楚。本研究于2011年9月到2012年12月通过动物实验，采用ELISA法测定血清TNF-α，用TUNEL法检测原位凋亡，探讨血清TNF-α与心肌细胞凋亡的关系及EPO对其的影响，为促红细胞生成素在脓毒症患者中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

180只健康Wistar大鼠，不分雌雄，体重为（20±2）g，购买于华中科技大学同济医学院实验动物中心，许可证号为：SCXK（鄂）2004-0007。

EPO（产品序号CSB-E04539m）以及ELISA试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司，脂多糖LPS购于SIGMA公司，产品序号L2880。用于TUNEL法检测原位凋亡的In situ cell death detection试剂盒购于德国Boehringer-Mannheim公司。

1.2 实验方法

将180只Wistar大鼠随机分为对照组、脂多糖LPS组及EPO处理组，每组60只，每小组分成2h、 4h、 6h、 12h、 24h五个亚组，每个亚组12只。脂多糖LPS组给予腹腔注射LPS 0.5mg/kg，对照组大鼠给予腹腔注射等量生理盐水，EPO组大鼠给予腹腔注射LPS 0.5mg/kg及EPO 4000U/kg。各亚组大鼠在所对应的时间点断头取血0.5mL，离心保存在-20℃冰箱等待检测。并即刻解剖取其心脏保存在-20℃冰箱。采用ELISA法测定血清TNF-α，用TUNEL法检测原位凋亡。

1.3 研究指标及测定方法

血清TNF-α浓度的测定：采用双抗体夹心ELISA法。TNF-α的浓度单位以pg/mL表示，试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司。严格按照试剂盒的说明书进行试验操作，显色以后从全自动酶标仪上直接读数得到TNF-α浓度值。

心肌细胞凋亡的测定：选用大鼠的左心室心肌行石蜡切片，严格按试剂盒说明书进行操作。每只大鼠观察10张切片，每张切片在光镜下（×400）随机选10个视野，图像分析用MICRO-COS-MOS MiVnt图片分析系统，得到阳性细胞百分率及阳性细胞胞浆胞核的平均光密度值（MOD），算出细胞凋亡指数AI（AI%=MOD×阳性细胞百分率×100）。

1.4 统计学分析

采用SPSS13.0软件进行统计学分析，TNF-α浓度及心肌细胞凋亡指数均为定量资料，采用均数±标准差（x±s）表示，运用方差分析；相关分析采用简单相关分析法。P

2 结果

2.1 内毒素血症Wistar大鼠血清TNF-α变化

LPS组TNF-α的浓度在2h时达到最大值，且明显高于生理盐水对照组（P0.05）。LPS+EPO组TNF-α浓度在2h时达到最大值，且明显低于LPS组（P

2.2 内毒素血症Wistar大鼠心肌细胞凋亡指数变化

LPS组心肌细胞凋亡指数在2h时达到最大值，且明显高于生理盐水对照组（P

2.3 内毒素血症Wistar大鼠心肌细胞凋亡指数与血清TNF-α之间的相关性

经过简单相关分析表明，内毒素血症Wistar大鼠心肌细胞凋亡指数与血清TNF-α存在明显的直线正相关性（r=0.7643，P

3 讨论

脓毒血症是临床上较多见的危重病，通常引起多器官功能的衰竭而导致患者死亡。脓毒血症是学界公认的导致重症病人死亡的首要因素，特别是脓毒症休克（sepsis shock）患者的死亡率达到46.5%。脓毒血症的发生常常是由于细菌分泌的内毒素释放进入血液。内毒素可使机体产生全身炎症反应综合症进而损伤多器官脏器，尤其是导致血液循环紊乱及心功能衰竭。脓毒症的发病机理十分复杂，涉及炎症、感染、组织损伤及免疫等诸多方面，并关系到多器官病理生理的改变。本实验结果表明，内毒素诱导的内毒素血症Wistar大鼠心肌细胞凋亡指数明显高于生理盐水对照组（P

机体受到LPS刺激后，巨噬细胞会明显上调TNFmRNA的表达，进而合成分泌TNF-α增加，可诱导细胞凋亡进而损伤心脏功能，与心力衰竭的发生发展有密切联系。TNF-α是活化T淋巴细胞及巨噬细胞分泌的免疫调节因子，其生物学活性十分广泛。正常人血清中的TNF-α浓度较低，感染性休克或脓毒症患者血清TNF-α浓度明显增加[5，6]。本实验结果显示，LPS组TNF-α浓度在2h时达到最大值，且明显高于对照组（P

EPO是人工克隆的生长因子，通常用于治疗贫血以促进红细胞的生成，在临床上得到广泛应用已久。EPO造血活性的主要机理不是直接刺激红细胞的产生，而是抑制晚红系祖细胞的凋亡[7]。可见EPO有延缓细胞凋亡的功能，其抑制细胞凋亡的具体机制目前尚不明确。有研究发现肝脏、脑、子宫等器官及肿瘤组织中有EPO受体的存在，EPO的其他临床功能逐渐得到重视[8]。近些年来对EPO的脑保护作用研究较多，EPO及其受体通过抗炎、抗凋亡、抗氧化等作用，可减轻神经组织缺血再灌注损伤。有报道指出EPO可明显延缓缺氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡，此外在器官水平的实验表明EPO可减少缺血再灌注心肌梗死及损伤心肌的范围，进而提高心功能[9，10]。本研究结果显示，LPS+EPO组TNF-α浓度在2h时达到最大值，且明显低于LPS组（P

本组研究结果显示，内毒素血症Wistar大鼠心肌细胞凋亡指数与血清TNF-α存在明显的直线正相关性（r=0.7643，P

总之，血清TNF-α参与了内毒素血症Wistar大鼠的心肌损伤的病理过程，与心肌细胞凋亡呈正相关性，EPO通过抑制TNF-α的产生而延缓心肌细胞凋亡，对内毒素血症Wistar大鼠的心肌具有保护作用。本研究结果为EPO治疗脓毒症患者心肌损伤提供了实验依据。

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（收稿日期：2013-08-14）