急性肺血栓栓塞溶栓治疗的动物实验研究

摘要：目的：建立一种良好的适合进行溶栓治疗实验研究的急性肺血栓栓塞动物模型。方法：24只日本大耳白兔，随机分为尿激酶溶栓组（UK组）、模型组（C组）、假手术组（S组），经右心导管注入条柱状自体血栓，心导管法监测血流动力学，制备急性肺血栓栓塞实验模型。在血流动力学和核素肺灌注扫描的基础上观察溶栓疗效，采用透射电镜法观察肺组织超微结构。结果：（1）肺栓塞后放射性核素肺灌注显像可见两肺野放射性分布不均，有放射性缺损和放射性稀疏现象，溶栓治疗后可见放射性充填。（2）肺动脉栓塞后可见肺动脉平均压（PAMP）与注栓前比较均有明显升高(P

关键词：溶栓治疗；肺血栓栓塞；动物模型；超微结构

中图分类号：R332文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0576-04

Experimental Study of Thrombolytic Therapy in Acute Pulmonary Thromboembolism

JIANG Qinhua1, XU Wen1, LI Guoping1, CHEN Yanfan2, WANG Liangxing2, CHEN Shaoxian2

(1.Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou 310012,Zhejiang,China;

2.The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000,Zhejiang,China)

Abstract:Objective：To establish an animal model of acute pulmonary thromboembolism that may be used for thrombolyitc therapy study. Methods：Twentyfour Japanese rabbits were randomly divided into Urokinase group(group UK),control group(group C) and sham operation group (group S).Acute pulmonary embolism models of rabbits were established with injection of autologous blood clots through the right heart catheters.Haemodynamic monitoring were performed by introducing heart catheter through right jugular vein.The ultrastructures of lung tissue were observed by electronic microscope. Results: (1)Radionuclide lung perfusion scan showed radio activity defect or attenuation after embolization and radioactivity filling after thromblysis. (2)PAMP was increased after embolization in both group UK and group C(P

Key words:thrombolytic therapy; pulmonary thromboembolism; animal model; ultrastructure

收稿日期：2011-10-20

基金项目：浙江省中医药科技计划资助项目(2004C125)

作者简介：姜琴华（1975-），女，浙江江山人，主治医师，硕士，研究方向：中西医结合防治血栓栓塞性疾病。

通讯作者：陈少贤（1946-），男，教授，硕士研究生导师。肺栓塞(pulmonary embolism, PE)是指内源性或外源性栓子栓塞肺动脉或其分支引起肺循环障碍的临床和病理生理综合征。肺血栓栓塞（pulmonary thromboembolism, PTE）是PE中最常见的一种类型。肺栓塞溶栓治疗为一类肺缺血后再灌注，其溶栓后血运重建是否发生缺血后再灌注损伤已越来越受到人们的重视。因此通过建立肺栓塞实验动物模型，对肺栓塞溶栓治疗后的病理、病理生理研究具有重要意义。本研究采用自体血栓注入法，建立兔急性肺栓塞实验模型，通过放射性核素肺灌注扫描显像明确肺栓塞面积和部位，并在血流动力学基础上观察溶栓疗效，探讨肺栓塞溶栓治疗的病理及病理生理变化。

1材料与方法

1.1实验动物

健康日本大耳白兔(温州医学院实验动物中心提供)24只，雌雄不拘，体重2.0~2.5kg。随机分成3组：（1）尿激酶溶栓组（Urokinase，UK组）8只，在注栓后2h予尿激酶（丽珠集团丽宝生物化学制药有限公司，粤卫药准字1996第006024号）20000U/kg，20mL生理盐水稀释后30min输入。（2）对照组（Control，C组）8只，注栓后同期输入等量生理盐水。（3）假手术组（Sham operation，S组）8只，接受手术，但未注栓。

1.2肺栓塞动物模型的制备

1.2.1麻醉动物3%异戊巴比妥钠30mg/kg兔耳缘静脉麻醉后，仰卧位水平固定兔于动物操作台上。行气管插管，连接DW-2000动物人工呼吸机（上海嘉鹏科技有限公司）辅助通气。吸入空气、呼吸频率30次/min、潮气量15mL/kg。

1.2.2置入导管游离左颈动脉和右颈外静脉，经左颈动脉穿刺插入聚乙烯导管留置。经右颈外静脉置入深静脉穿刺管（美国ARROW公司）至肺动脉，导管另一端通过YL-4型压力传感器与SJ-42型四道生理记录仪相连，记录肺动脉压力波。为避免凝血，各管路均间断使用灭菌生理盐水封管。

1.2.3自体血栓制备从颈动脉抽血0.5mL，注入含凝血酶10U的聚乙烯管（直径为1mm）中，放置37℃水浴箱水浴20min。将血栓置于消毒平皿上切成长约3~4mm柱行血栓，用灭菌生理盐水反复冲洗后，记数50个备用。

1.2.4输入自体血栓经深静脉导管注入柱形自体血栓（直径1mm，长度3~4mm），反复注入使肺动脉收缩压（PASP）维持于40~50mmHg左右，共30min，其后稳定1h。S组输入10mL生理盐水。

1.3观察指标

1.3.1肺动脉平均压（PAMP）测定分别在注栓前、注栓即刻、注栓后2h、溶后1h、2h、4h根据肺动脉压力波计算PAMP。

1.3.2放射性核素肺灌注扫描显像（ECT）分别在注栓后1h及动物处死前由颈外静脉注入99m 锝大分子聚合蛋白（99mTC-MMA），经肺扫描观察肺部显像。

1.3.3电镜标本制作及观察每组3例，取新鲜肺组织1mm×1mm×1mm2~3块，2.5%戊二醛和1%锇酸常规固定，Epon812包埋，LKB-V型切片机切片，H-600型透射电镜观察。

1.4统计学处理

采用SPSS 17.0软件处理，所有数据均用±s表示，各组间及同组内不同阶段均数的比较用方差分析。

2结果

2.1各实验组溶栓前后的PAMP变化

实验显示注入栓子后C组及UK组的肺动脉平均压（PAMP）与注栓前比较均有明显升高(P

表1各实验组溶栓前后的PAMP变化(mmHg, ±s)

组别n注栓前注栓后2h溶栓后1h2h4hC组611.0±2.829.0±3.7*27.1±4.0*25.8±3.6*25.3±3.8*UK组610.5±2.329.1±3.4*22.9±3.3*19.0±3.2*16.7±2.4*S组810.4±1.611.1±1.610.9±1.810.6±1.710.5±1.8注：*与注栓前比较P

2.2放射性核素肺灌注显像

C组：注栓后可见两肺野放射性分布不均匀，有放射性缺损和放射性稀疏现象。UK组：注栓后可见两肺野放射性分布不均匀，左肺中部外侧见放射性缺损，左肺下部、右肺下部见明显放射性稀疏（图1），溶栓后可见左肺中部、下部及右肺下部明显放射性充填（图2）。S组：右肺面积较左侧稍大，两肺放射性呈生理性分布，肺外带边缘及肺尖部放射性分布稍稀疏，但轮廓完整（图3）。

2.3各实验组肺组织超微结构

S组兔肺组织超微结构正常，肺泡Ⅱ型上皮细胞表面微绒毛丰富，细胞内板层小体较多，毛细血管内皮细胞结构正常（图4）。C组可见肺泡Ⅱ型上皮细胞微绒毛减少，细胞内板层小体数量较多（图5），血管内皮细胞结构较正常未见明显改变。UK组可见肺泡Ⅱ型上皮细胞脱落，数量较C组明显减少，上皮细胞内板层小体减少，表面平坦，微绒毛极少，线粒体有空泡变性（图6），内皮细胞可见空泡变性，部分内皮细胞线粒体肿胀，并可见核固缩现象。

3讨论

3.1急性PTE的动物模型

本实验在许俊堂等[1]和梁心平等[2]急性PTE模型建立的基础上加以改进，采用肺动脉内注入凝血酶处理的自体血栓建立兔急性PTE模型。PE动物模型的制备方法可分为两种,即体内血栓形成法和体外栓子注入法。体内血栓形成由于模拟了PTE发病时的血液高凝状态,所以能准确反映机体状况,但PTE形成后血管的复通率、模型的持久性等问题有待进一步研究探讨。体外栓子注入法是将栓子注入体内形成PE模型。文献表明，可用来制作PE模型的栓子很多，包括：血凝块、微粒子、玻璃体、球状物、α-凝血酶、明胶海绵等。最客观、真实、理想的栓子仍是自体血凝块。因为血液在试管内凝固与静脉血栓形成过程相似，即与最易脱落的血栓―红色凝血血栓类似，且PTE的“母血栓”85%来自下肢静脉[3]。然而，由于实验模型缺乏相应的血栓形成的易患因素，自体血凝块的极易溶解和碎裂使其应用受到一定限制。在体外使用凝血酶处理的血凝块，因其很快失活，对体内凝血无影响，形成的血栓接近体内自然形成者，是理想的制备PTE模型的栓子。目前国内外对PTE溶栓前后病理、病理生理变化的研究主要通过结扎或钳夹肺动脉、气囊堵塞肺动脉以及经导管用异物封堵肺动脉的方法制作肺血管缺血再灌注动物模型[4-7]，这些模型虽可明确再灌注时间点，但不能很好反映血栓栓塞时机体的应答状态。

图1S组放射性核素肺灌注显像：右肺面积较左侧稍大，两肺放射性呈生理性分布，肺外带边缘及肺尖部放射性分布稍稀疏，轮廓完整

图2UK组放射性核素肺灌注显像（前位）：注栓后可见两肺野放射性分布不均匀，左肺中部外侧见放射性缺损，左肺下部、右肺下部见明显放射性稀疏。

图3UK组放射性核素肺灌注显像（前位）：溶栓后可见左肺中部、下部及右肺下部明显放射性充填

图4S组电镜下见毛细血管内皮细胞结构正常（×10K）

图5C组电镜下见肺泡Ⅱ型上皮细胞微绒毛减少，细胞内板层小体数量较多（×10K）

图6UK组电镜下见肺泡上皮细胞胞浆疏松，板层小体排空，内质网扩张，线粒体空泡变性（×17K）

本实验利用肺动脉压力控制栓子注入，使各模型组动物血流动力学参数相对保持一致，保证了实验结果的可比性。实验显示，起始栓子注入引起的PAMP升高维持时间很短，很快降至正常，随着栓子不断注入，少量栓子即可引起压力明显升高，维持时间越来越长。实验中UK组有2只兔于栓塞后1h及溶栓后2h死亡，C组有2只兔分别于栓塞后2h及溶栓后3h死亡。尸检发现有肺水肿，气管腔内见大量分泌物，栓子堵塞一侧或两侧肺动脉。这4只兔未纳入统计数据。

3.2急性PTE模型制备成功和溶栓治疗有效的标准

本实验在血液动力学基础上，利用放射性核素肺灌注扫描显像明确PTE溶栓治疗前、后栓塞的面积和部位，观察溶栓疗效。核素肺灌注显像不仅是诊断PTE的重要方法，而且可以准确观察急性PTE溶栓治疗前后肺血流灌注的动态变化过程，其显像方法简便、无创，是评价疗效的理想方法[8]。国外已有应用肺灌注显像观察PTE溶栓后早期血流灌注变化的研究，证实了溶栓后早期，肺血流灌注可以得到迅速改善[9]。我们的实验结果表明，注栓后即刻可见PAMP明显升高，UK组在溶栓后1h PAMP有明显下降，与溶栓前比较下降了20%左右，而C组在栓子注入后的6h中PAMP均无显著性变化。放射性核素肺灌注显像结果显示C组及UK组注栓后均可见两肺野放射性分布不均，有放射性缺损和放射性稀疏现象，UK组在溶栓后可见放射性充填。由此表明，本实验兔急性PTE模型制备成功，溶栓有效。

3.省略。显的肺损伤。

本研究发现，UK组可见肺间质及肺泡水肿、出血、炎性细胞浸润、纤维蛋白渗出，肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤明显，II型上皮细胞脱落。而C组损伤程度较UK组明显减轻。由此表明，急性PTE2h后予溶栓治疗，可引起肺组织的再灌注损伤。

本实验采用肺动脉内注入凝血酶处理的自体血栓建立兔急性PTE模型，在血液动力学基础上，利用放射性核素肺灌注扫描观察溶栓疗效。模型制备方法简便，为肺栓塞溶栓治疗的研究提供一种较好的动物模型。我们研究发现，急性PTE2h后予溶栓治疗，可引起肺组织的再灌注损伤，其具体机制有待进一步研究。

参考文献

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