金氏痔痛贴的药效学作用实验研究

摘要：目的：观察金氏痔痛贴（Jin’s Hemorrhoid Patch, JHP）的止血、镇痛作用。方法：采用断尾法测定出血时间，玻片法测定凝血时间；测定大鼠凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）及血小板聚集功能。通过热板法及化学刺激法观察各组小鼠的镇痛作用；采用双抗体夹心法（ELISA法）检测降钙素基因相关肽(Calciton in gene - related peptide, CGRP)水平变化。结果：金氏痔痛贴能明显缩短大鼠的出血时间和凝血时间，且与云南白药相比，差异有显著性意义；金氏痔痛贴能明显缩短大鼠的PT和APTT，并能增强大鼠的血小板聚集功能；该药对热传导及化学刺激引起的拟痛反应有明显的镇痛作用；该药对大鼠血浆CGRP水平有显著升高作用。结果均具有统计学意义（P

关键词：金氏痔痛贴；止血；镇痛；CGRP；ELISA

中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717(2012)03-0585-03

Studies on Pharmacodynamic of Jin’s Hemorrhoid Patch by Experimental Modal

JIN Ying1，JIN Chun2，XIE Jiebin1，ZHENG Chenguo2，YE Lechi1，CHEN Rong2

(1.Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000, Zhejiang,China；

2.The Second Hospital Affiliated to Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000,Zhejiang, China)

Abstract:Objective: To investigate the hemostatic and pain-relieving effects of Jin’s hemorrhoid patch. Methods:Animals were randomly divided into six groups.he bleeding time was tested by adopting mouse tail-cutting method.The coagulation time was tested by taking slide method；the values of PT and APTT were determined. Platelet aggregative function in rats was detected,too.The pain-relieving effect was tested by observing the mouse’s reaction to the pain simulated by heat conduction and chemical stimulus. And plasma Calciton in gene - related peptide（CGRP）level in contrast was investigated by ELISA assay. Results: Jin’s hemorrhoid patch could significantly shorten the bleeding and coagulation time. It could reduce the levels of PT and APTT in rats while it enhanced platelet aggregative function in rats.Jin's hemorrhoid patch could relieve the pain stimulated by heat conduction and chemical stimulus. Furthermore,it also could increase plasma level of CGRP significantly in rats.All has statistical significance（P < 0.01）. Conclusion：Jin’s hemorrhoid patch has strong hemostatic and pain-relieving effect.

Key words:Jin’s hemorrhoid patch；hemostatic；pain-relieving effect；CGRP；ELISA

收稿日期：2011-10-15

基金项目：浙江省中医药管理局资助项目（2009JA003）

作者简介：金莹（1985-），女，浙江上虞人，医师，硕士，研究方向：大肠疾病。

通讯作者：陈荣（1963-），男，浙江温州人，主任医师，研究方向：大肠疾病。金氏痔痛贴由我院中西医结合肛肠科总结多年的临床经验提出，其主药组成为：槐米、延胡索、三七、甘草等制成黑膏药贴剂。本研究通过动物实验观察其止血、镇痛的作用，现报道如下。

1材料

1.1实验动物昆明种小鼠，体重为（20±2）g；健康清洁级SD大鼠，雌雄兼半，体重为（220±20）g，均由温州医学院实验动物中心提供。

1.2实验药物金氏痔痛贴（JHP，温州医学院附属第二医院实验制剂）；止痛消炎软膏 (ZTXY Ruan gao)，国药准字Z33020984，批号：100407，由康恩贝集团生产；云南白药膏(YNBY)，规格：6.5cm×10cm，国药准字Z20073015，批号：100407~100111，由云南白药集团无锡药业有限公司生产。

1.3试剂与仪器PT测定试剂盒（批号：106000）、APTT测定试剂盒（批号：105753）均由法国STAGO-R公司提供。二磷酸腺苷二钠（ADP，上海伯奥生物技术有限公司，批号：070508）；冰醋酸；滤纸；秒表；载玻片；大鼠降钙素基因相关肽(CGRP)ELISA试剂盒，购自上海西唐生物科技有限公司；法国STAGO-R全自动血凝仪；Chrono-log 560vs血小板聚集仪。

2方法

2.1对SD大鼠出血、凝血时间的影响[1]取健康SD大鼠60只，随机分为6组，即金氏痔痛贴大(JHPh)、中(JHPm)、小(JHPl)剂量组，分别给药0.9g生药/220g、0.45g生药/220g和0.225g生药/220g；云南白药膏组：6.5cm×2.5cm/220g；赋形剂组：0.45g/220g；各组于实验前1天，将大鼠背部靠近骶尾部毛去除干净（面积为4cm×6.5cm）。实验当日，将各药物贴于脱毛处，用不致敏胶布固定，分笼饲养，每天换药1次，连续7天。于末次给药后12h，将大鼠固定剪尾5cm，立即记时，每隔30s用滤纸吸去血滴，至不再出血为止为出血时间。另取SD大鼠60只，分组及给药方式同前，于末次给药后12h，将大鼠固定，摘去一侧眼球取血，于载玻片的两端各滴一滴血，血滴直径约5mm，立即用秒表记时。每隔30s用清洁大头针自血滴边缘向里轻轻拨动1次，并观察有无血丝挑起。从采血开始至挑起血丝止，所历时间即凝血时间。另一滴血供最后复验，记录凝血时间。结果见表1。

2.2金氏痔痛贴对SD大鼠的PT、APTT的影响取清洁级SD大鼠60只，分组及给药方式同2.1。于末次给药后12h，用10％水合氯醛(0.4～0.6mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠，打开腹腔，从腹主动脉取血2.7mL，放入加有3.8％枸橼酸钠溶液的试管内（血液与枸橼酸钠的比例为9∶1），混匀后以3000r・min-1离心10min，获得贫血小板（PPP）血浆，然后采用自动凝血分析仪测定PT、APTT。结果见表2。

2.3金氏痔痛贴对SD大鼠的血小板聚集率的影响取清洁级SD大鼠60只，分组、给药方式及采血均同2.2。混匀后以1000r・min-1离心15min，取上层富血小板血浆（PRP）450μL，剩余部分继续以3000r・min-1离心10min，分离贫血小板（PPP）血浆，以贫血小板血浆（PPP）为对照管调零，在富血小板血浆（PRP）中加诱导剂3.33μmol/LADP 40μL，按比浊法于血液凝聚仪测定血小板聚集程度。结果见表3。

2.4对小鼠热板法镇痛的影响[1]因雄性小鼠受热阴囊触及热板，可出现假性结果，所以实验采用雌性小鼠。调节恒温器水温至(55.0±0.5)℃，将500mL烧杯放入其中，使烧杯底部接触水面。每次取昆明种雌性小鼠1只，放入烧杯内。记录自放入烧杯至出现舔后脚所需时间(s)，作为该鼠的痛阈值。凡舔后足时间小于5s或大于30s或跳跃者弃之不用。间隔1h，重复测定其正常痛阈值，取两次正常痛阈平均值，作为该鼠的给药前的基础痛阈值，以平均值不超过30s为合格。将合格小鼠随机分为6组，每组10只，分别为：金氏痔痛贴大(JHPh)、中(JHPm)、小(JHPl)剂量组分别给药（0.9g生药/20g、0.45g生药/20g、0.225g生药/20g）；止痛消炎软膏组：0.45g生药/20g；赋形剂组：0.45g/20g。次日将小鼠背部靠近骶尾部将毛去除干净（面积为1cm2）。将适量受试品或对照品贴于脱毛处，用不致敏胶布固定在小鼠背部，以不影响其舔足为度。分笼饲养，每天换药1次，连续7天。在第7天给药后6h各测定小鼠的痛阈值。小鼠出现舔足反应后，迅速将其取下，以免烫伤。若60s仍无反应，立即取出，其痛阈按60s计算。以小鼠出现舔足反应的时间差(痛阈值 )为观察指标，计算药物镇痛百分率。结果见表4。

2.5对小鼠醋酸扭体法镇痛的影响[1]实验动物、分组、给药同2.4项下。分笼饲养，每天换药1次，连续7天。在第7天给药后6h，揭去受试物，用温水擦拭干净，避免影响其扭体反应。用0.6%的醋酸溶液，按0.1mL/10g的剂量，腹腔注射。以给醋酸后15min内，各受试小鼠出现扭体（腹部内凹、伸展后肢、臀部抬高）次数为观察指标，计算扭体反应发生次数。结果见表5。

2.6对大鼠血浆CGRP水平测定结果取健康清洁级SD大鼠60只，分组及给药方式同2.1。于末次给药后12h,用10％水合氯醛(0.4～0.6mL/100g)麻醉大鼠，从腹主动脉取血5mL，注入EDTA-2Na(1g/L)和抑肽酶(50mU/L)的试管中，摇匀，4℃，3000r/min离心10min分离出血浆1份，置-70℃低温冰箱保存，待测CGRP值。结果见表6。

2.7统计学处理方法应用SPSS 16.0软件。所有计量数据采用均数±标准差（±s）表示。多组间比较用单因素方差分析。

3结果

3.1对SD大鼠凝血、出血时间的影响金氏痔痛贴大剂量组的凝血时间明显短于中、小剂量组、云南白药组及赋形剂组（P0.05）；金氏痔痛贴大剂量组的出血时间明显短于小剂量组和赋形剂组（P0.05）。见表1。

表1不同剂量金氏痔痛贴及云南白药对

大鼠凝血、出血时间的影响

组别n给药剂量凝血时间(s)出血时间(s)大剂量组100.9g生药/220g45.50±10.08**107.7±23.9**中剂量组100.45g生药/220g69.2±10.76**147.4±43.02**小剂量组100.225g生药/220g87.8±13.51**236.6±88.66**云南白药106.5cm*2.5cm/220g85.3±11.47**153.1±59.82**赋形剂组100.45g基质/220g122.70±14.46438.6±71.31注：与赋形剂组比较:**P< 0. 01 ;与云南白药组: P < 0. 01，P< 0. 05; 与小剂量组比较: P < 0. 01，P< 0. 05。

3.2金氏痔痛贴对SD大鼠的PT、APTT的影响金氏痔痛贴各个剂量组的PT、APTT时间均明显短于赋形剂组（P 0. 05）。见表2。

表2不同剂量金氏痔痛贴及云南白药

对大鼠PT、APTT的影响

组别n给药剂量PT/sAPTT/s大剂量组100.9g生药/220g 17.19±1.29**18.68±0.85**中剂量组100.45g生药/220g15.70±1.40**17.89±1.34**小剂量组100.225g生药/220g17.45±1.67**21.03±2.35**云南白药106.5cm *2.5cm /220g 17.32±1.35**20.30±1.68**赋形剂组100.45g基质/220g21.77±2.8124.55±2.18注：与赋形剂组比较: **P0.05; 与小剂量组比较: P

3.3金氏痔痛贴对SD大鼠的血小板聚集率的影响金氏痔痛贴中剂量组的血小板聚集率明显高于大、小剂量组及赋形剂组和空白对照组（P0. 05）。见表3。

表3不同剂量金氏痔痛贴及云南白药对

大鼠血小板聚集率的影响

组别n给药剂量ADP(最大聚集率)大剂量组100.9g生药/220g 61.4±12.5*中剂量组100.45g生药/220g80.8±10.5**小剂量组100.225g生药/220g62.2±11.3*云南白药106.5cm*2.5cm /220g 78.4±12.5**赋形剂组100.45g基质/220g46.7±10.0注：与赋形剂组比较: *P

3.4对小鼠热板法镇痛的影响金氏痔痛贴各剂量组与赋形剂组比较，能明显提高小鼠热板法痛阈值，均有显著性差异 (P≤0.01)；止痛消炎软膏组与金氏痔痛贴各剂量组相比，无明显差异(P>0.05)，提示其提高小鼠热板法痛阈值效果相当；金氏痔痛贴各剂量组镇痛率，与剂量呈线性关系：大剂量优于中、小剂量组；止痛消炎软膏组镇痛率与金氏痔痛贴中剂量组相当。结果见表4。

表4金氏痔痛贴剂对小鼠热板法镇痛的作用

组别n给药剂量用药前 (s)6h后(s)延长率(%)大剂量组100.9g生药/220g 11.34±3.6322.62±7.38**99.47中剂量组100.45g生药/220g11.64±4.2521.40±4.41**83.85小剂量组100.225g生药/220g11.70±3.9320.77±4.10**77.52止痛消炎100.45g生药/220g11.61±4.2921.48±5.65**85.01赋形剂组100.45g基质/220g12.38±4.3112.16±4.54注：与赋形剂组比较 : **P

3.5对小鼠醋酸扭体法镇痛的影响金氏痔痛贴各剂量组与赋形剂组比较，能显著降低小鼠扭体发生次数(P0.05)，提示其降低小鼠扭体发生次数效果相当；金氏痔痛贴各剂量组减少扭体发生次数，与剂量呈线性关系：大剂量优于中、小剂量组。结果见表5。

表5金氏痔痛贴剂对小鼠醋酸法镇痛的作用

组别n给药剂量15min内扭体次数大剂量组100.9g生药/220g 7.00±3.89**中剂量组100.45g生药/220g14.30±5.10**小剂量组100.225g生药/220g15.70±6.96**止痛消炎100.45g生药/220g12.90±6.49**赋形剂组100.45g基质/220g28.60±7.02注：与赋形剂组比较 : **P

3.6对大鼠血浆CGRP水平测定结果6组SD大鼠进行药物干预7天后，其血浆CGRP水平结果显示：与赋形剂组相比，金氏痔痛贴大剂量组有显著升高(P

表6不同剂量金氏痔痛贴及消炎止痛软膏

对大鼠CGRP水平的影响

组别n给药剂量CGRP大剂量组100.9g生药/220g629.21±131.88**中剂量组100.45g生药/220g522.74±117.32*小剂量组100.225g生药/220g413.72±124.02止痛消炎100.45g生药/220g427.70±183.69赋形剂组100.45g基质/220g342.50±103.62注：与赋形剂组比较，**P

4讨论

金氏痔痛贴与金可可等[2]研究的金氏痔疮膏虽均由我院中西医结合肛肠科主任医师、部级名中医金定国总结多年的临床经验提出的，但前者是由槐米、延胡索、三七、甘草等制成的黑膏药贴剂，后者是由大黄、槐花、牛黄、珍珠、升麻、姜黄和冰片等组成的膏剂，这两者组方、剂型均不一样，从不同用药角度来治疗痔疮疾病的。本实验从出血时间、凝血时间及PT、APTT和血小板聚集功能方面观察其止血作用，通过热板法、化学刺激法及CGRP指标综合反映该药的镇痛效果。

出血时间、凝血时间与毛细血管功能、凝血因子、血小板数量和功能等因素有关[3]； PT、APTT[4]时间分别反映外源性和内源性凝血途径的状况；三七能促进组织胺引起的血管收缩，还能通过影响血小板的变形、黏附、聚集和释放起止血作用[5]。实验表明：金氏痔痛贴大、中、小剂量均能使大鼠出血时间、凝血时间明显缩短，与赋形剂组比，差异显著(P0.05），说明其与云南白药的止血作用相当。该药作用的大鼠PT、APTT与赋形剂组比较均明显缩短，各个剂量组与云南白药作用相当；还能增强由 ADP诱导的血小板聚集功能。以上实验结果共同说明金氏痔痛贴可能作用于毛细血管功能、凝血途径、血小板聚集，从而达到止血的目的。因此可用于治疗痔疮的出血症状。

小鼠热板试验和扭体试验是研究镇痛药物的常用筛选模型，经典可靠，但两者致痛机制不同。热板试验为热刺激致痛，引起的是躯体体表痛。扭体试验是化学刺激剂致痛，引起的是内脏痛[6]。实验表明：金氏痔痛贴各剂量均能延长大鼠对疼痛的反应时间，可以推测金氏痔痛贴的镇痛机制在于对外周及内脏的联合镇痛。CGRP是体内作用最强的舒血管生物活性多肽，具有很强的扩血管作用，可以明显拮抗目前使用的所有收缩剂[7]。目前，关于贴剂与CGRP的相关研究尚未见报道，本实验设想通过测量CGRP的浓度来衡量贴剂作用于大鼠体表能否实现扩张血管的功能，从而减轻疼痛的作用。结果表明：金氏痔痛贴能升高血浆CGRP含量，且升高的程度与药物剂量成正比，并且金氏痔痛贴升高血浆CGRP含量优于止痛消炎软膏。但是此结果与其止血作用的机制有矛盾，因为止血作用不排除通过收缩血管而起的作用。因此，我们猜想也许其止血的主要原理不是通过收缩血管，但是至于两则之间的具体关系还需要进一步的研究。

参考文献

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[7]颜玲，陈合新，邵正仁. CGRP肽能神经在皮肤组织中的分布及其意义［J］.中国临床解剖学杂志，2009，27（4）：444-447.