注射雪胆乙素在大鼠体内药动学研究

[摘要] 建立血浆样品中雪胆乙素的测定方法，研究雪胆乙素在大鼠体内的药动学特征。大鼠经尾静脉注射给药，以苯海拉明为内标（internal standard，IS），采用液相色谱-串联四级杆质谱（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法测定不同时间点大鼠血浆中雪胆乙素浓度。质谱采用电喷雾（ESI） 离子源，多反应监测模式正离子检测，确定目标化合物及内标的离子对分别为m/z 503.2/113.1和m/z 256.0/167.2。色谱柱为Agilent ZOBAX SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），甲醇-0.1%甲酸55∶45等度洗脱，流速为0.2 mL・min-1。采用DAS 2.0软件对所得的血药浓度进行拟合，求算相应的药动学参数。大鼠经尾静脉注射雪胆乙素3.0 mg・kg-1，目标物血浆质量浓度在10.5～3 150 μg・L-1内线性关系良好（R2=0.996），标准曲线定量下限为10.5 μg・L-1，信噪比S/N=12；日内精密度RSD

[关键词] 雪胆乙素；LC-MS/MS；药动学特征

[收稿日期] 2014-01-19

[通信作者] 姚庆强，博士，硕士生导师，Tel：（0531）82919960，E-mail：

[作者简介] 徐晓婷，硕士研究生，Tel：15053135218，E-mail：

雪胆别名金龟莲、金盆、罗锅底等，为葫芦科植物雪胆Hemsleya amabilis Diels及其同属数种植物的干燥块根，性味苦，寒，具有清热解毒，利湿消肿，健胃止痛的功效[1]。雪胆属植物主要分布于我国西南地区，其中云南、四川、贵州拥有该属植物的92%[2-3]。雪胆为我国传统中药材，现收载于《中药成方制剂》（第19册），广泛用于治疗菌痢、肠炎、支气管炎、急性扁桃体炎等[4]。大量文献报道发现，雪胆属植物富含葫芦素类化合物，具有细胞毒、抗癌、抗菌抗炎、抗HIV等多种药理活性[5-8]。雪胆乙素（cucurbitacin Ⅱ） 是从雪胆药材中提取的一种四环三萜类成分，目前已有雪胆乙素抑制肿瘤细胞的相关报道[9-10]，但尚未发现雪胆乙素在大鼠体内药动学方面的研究。本研究采用液相色谱-串联四级杆质谱（LC-MS/MS） 法测定大鼠血浆中雪胆乙素的浓度，首次阐明了雪胆乙素经尾静脉注射给药后大鼠体内的药动学特征，为其在临床研究和新药设计提供理论依据。

1 材料

1.1 药品与试剂 雪胆乙素对照品，由本实验室从雪胆药材中分离制得，经HPLC分析纯度为98.6%；盐酸苯海拉明（内标物质），购于中国食品药品检定研究院，批号为100066-200807；氯化钠注射液，购于辰欣药业股份有限公司，批号为1206085121。甲醇、乙腈为色谱纯，购于美国TEDIA公司和Burdick Jackson公司；水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

1.2 动物 健康雄性Wistar大鼠，体重（230±10） g，购于山东大学实验动物中心，动物合格证号SCXK（鲁） 2009-0001。实验前于本室动物房饲养7 d，饲养温度为20～25 ℃，饲养环境湿度为（45±10）%。

1.3 仪器 Agilent 6410三重四级杆质谱仪，配有电喷雾（ESI） 离子化源，购自美国Agilent公司；Agilent 1200高效液相色谱仪，包括二元泵、在线脱气机、柱温箱、自动进样器，购自美国Agilent公司；XS105电子天平，购自瑞士Mettler公司；TGL-16G高速台式离心机，购自常州澳华仪器有限公司；SK-1快速混匀器涡流混悬仪，购自常州澳华仪器有限公司；多功能样品浓缩仪，购自北京普立泰科仪器有限公司。

2 方法

2.1 质谱条件 采用电喷雾（ESI） 离子源，多反应监测模式（MRM），正离子方式检测，雪胆乙素和内标的碰撞诱导解离电压（CID） 分别为25，20 eV；碎裂电压分别为110，120 V；毛细管电压（±） 4.0 kV；干燥气流速10 L・min-1；干燥气温度325 ℃；雾化气压力241.325 kPa；碰撞气为高纯氮气。用于定量分析雪胆乙素和内标的离子对分别为m/z 503.2/113.1和m/z 256.0/167.2。质谱设置0～1.5 min，源外检测；1.5～5.1 min，源内检测。

2.2 色谱条件 Agilent ZOBAX SB-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱温30 ℃；流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B） 55∶45，等度洗脱；流速为0.2 mL・min-1；进样量5 μL。

2.3 对照品储备液及内标溶液的配制 精密称取雪胆乙素对照品10.65 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配成质量浓度为1 050 mg・L-1的雪胆乙素储备液，置于-4 ℃冰箱中备用。

精密称取内标盐酸苯海拉明对照品1.14 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配成苯海拉明质量浓度为100 mg・L-1的内标储备液。精密量取内标储备液，用甲醇稀释成质量浓度为50 μg・L-1的内标溶液，置于-4 ℃冰箱中备用。

2.4 标准溶液血浆样品的配制 精密量取雪胆乙素对照品储备液，甲醇逐级稀释得0.105，0.315，1.05，3.15，10.5，31.5 mg・L-1系列对照品标准溶液。取上述对照品溶液各20 μL，加入180 μL空白血浆，配成雪胆乙素血浆质量浓度分别为10.5，31.5，105，315，1 050，3 150 μg・L-1的标准血浆样品。

2.5 质控血浆样品的配制 按2.4项方法制备雪胆乙素低、中、高3个质量浓度质控血浆样品（分别为31.5，315，2 835 μg・L-1） 。

2.6 血浆样品的处理 取血浆样品50 μL，依次加入甲醇100 μL，内标溶液50 μL，涡流混合1 min，沉淀蛋白，于1万 r・min-1离心5 min，取上清5 μL进行LC-MS/MS分析。

2.7 药代动力学实验 健康雄性Wistar大鼠6只，给药前12 h禁食，自由饮水。尾静脉注射雪胆乙素3.0 mg・kg-1[用生理盐水和聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温80）将雪胆乙素溶解配成质量浓度为0.3 g・L-1的澄清尾静脉注射液，吐温80质量分数

3 结果

3.1 专属性考察 取大鼠空白血浆，加入内标及目标化合物的血浆，大鼠尾静脉给药30 min后血浆样品各50 μL，按2.7项下方法处理后进样分析，记录色谱图。通过色谱图的比较发现，见图1，在本实验条件下，雪胆乙素和内标物有较大的色谱峰和较好的分离度，且大鼠血浆中内源性基质及代谢物不干扰样品峰测定。雪胆乙素和内标物的保留时间分别为3.62，1.88 min。

3.2 标准曲线及线性关系的考察 取2.4项下标准溶液血浆样品，按2.6项下血浆样品处理方法处理后进样测定。以待测物质量浓度x（μg・L-1） 为横坐标，待测物峰面积与内标峰面积比值y为纵坐标，采用加权最小二乘法（权重因子1/x2） 进行线性回归，得线性回归方程为y=0.045 4x-0.007 94（R2=0.996）。实验结果表明，雪胆乙素血浆质量浓度在10.5～3 150 μg・L-1线性关系良好。将标准曲线最低点连续进样6针，确定雪胆乙素的最低定量下限为10.5 μg・L-1，精密度RSD≤11.4%，准确度RE≤8.9%，满足方法学要求。

3.3 精密度和准确度 取2.5项下低、中、高3个浓度质控样品各6份，按2.6项下方法处理后进样分析，连续测定3 d，根据当日标准曲线测定质控样品浓度，计算该方法的日内、日间精密度（RSD） 和准确度（RE）。低、中、高3浓度质控样品日内精密度RSD

3.4 回收率 取2.5项下低、中、高3个浓度质控样品各3份，按2.6项下方法处理后进样分析，以雪胆乙素在血浆中经提取处理后的测定值与相应浓度标准溶液测定值相比，计算雪胆乙素的提取回收率，采用同样的方法计算内标的提取回收率。雪胆乙素低、中、高3个质量浓度（31.5，315，2 835 μg・L-1） 的提取回收率分别为（92.7±2.5）%，（97.1±3.4）%，（96.6±1.4）%；内标的提取回收率为（96.1±1.5）%。

3.5 基质效应 取50 μL大鼠空白血浆6份，分别加入200 μL甲醇沉淀蛋白，涡流混合1 min，于1万 r・min-1条件下离心5 min，取上清液230 μL置于玻璃试管中，经氮气吹干，依次加入50 μL内标溶液，50 μL低、高质控浓度对照品溶液各3份，经超声、涡流混合后取上清液进样测定，记录被测物峰面积与内标峰面积的比值（记为A）；另取50 μL水6份，按上述方法处理后，记录被测物峰面积与内标峰面积的比值（记为B）。计算A/B的比值，得雪胆乙素低、高浓度及内标的基质效应分别为（102.7±14.9）%，（100.0±4.7）%，（103.9±4.9）%。实验结果表明血浆中基质对目标化合物和内标具有较弱的离子增强作用，但并不影响该定量方法的准确性，可忽略不计。

3.6 稳定性 按2.5项下方法制成雪胆乙素血浆质量浓度分别为31.5，2 835 μg・L-1的低、高浓度血浆样品，考察血浆样本室温放置4 h，提取后在自动进样器放置12 h，3次反复冻融稳定性和-20 ℃长期冷冻7 d稳定性。结果显示质量浓度变化范围在85%～115%，表明雪胆乙素在贮存及测定过程中均是稳定的。

3.7 大鼠体内药动学 采用DAS 2.0软件以非房室模型求算相应的药动学参数，见表2，血药浓度-时间曲线见图2。

4 讨论

本研究通过对大鼠口服雪胆乙素（60 mg・kg-1） 后血浆样品检测发现原型药物雪胆乙素难以检出，因此笔者将雪胆乙素制成注射液以研究其在大鼠体内的药动学特征。

实验采用电喷雾（ESI） 离子源，选择多反应监测（MRM） 模式以正离子进行质谱扫描，同时选择和检测2组特定且直接相关的离子对，实现对前体离子和产物离子同时监测。在本实验色谱条件下，既能与生物样品中的内源性基质实现分离，又使得待测物在较短的时间内出峰。在色谱分离过程中还发现，若在流动相中加入适量的甲酸灵敏度显著提高，于是选择在流动相中加入0.1%的甲酸以提高灵敏度。

本文采用LC-MS/MS建立了定量分析血浆中雪胆乙素的方法，首次考察了雪胆乙素在大鼠体内的药动学研究。尾静脉注射雪胆乙素的药动学参数AUC0-t为（811.615±111.578） μg・h・L-1，t1/2为（1.285±1.390） h，CL为（3.627±0.487） L・h・kg-1，Vd为（6.721±7.429） L・kg-1。该法操作简便、快捷，具有分析时间短（5.1 min）、灵敏度高（10.5 μg・L-1） 的优点，已成功应用于雪胆乙素注射液在大鼠体内药动学研究，为其在临床研究和新药设计提供理论基础和依据。

[参考文献]

[1] 董建勇，岳磊，邵薇薇，等. 中华雪胆化学成分研究（Ⅲ）[J]. 中国中药杂志，2012，37（6）： 814.

[2] 聂瑞麟. 葫芦科植物三萜皂甙研究十年进展（1980―1992）[J]. 云南植物研究，1994，16（2）： 201.

[3] 白敏，李宏亮，徐贵丽. 雪胆属植物化学成分及药理活性研究进展[J]. 昆明医学院学报，2012，33（1B）： 177.

[4] Chen J C，Niu X M，Li Z R，et al. Four new cucurbitane glycosides from Hemsleya jinfushanensis[J]. Planta Med，2005，71（10）： 983.

[5] Fuller R W，Cardellina J H，Cragg G M，et al. Cucurbitacins： differential cytotoxicity，dereplication and first isolation from Gonystylus keithii[J]. J Nat Prod，1994，57（10）： 1442.

[6] Boykin C，Zhang G，Chen Y，et al. Cucurbitacin Ⅱa： a novel class of anti-cancer drug inducing non-reversible actin aggregation and inhibiting survivin independent of JAK2/STAT3 phosphorylation[J]. Brit J Cancer，2011，104（5）：781.

[7] Alghasham A A. Cucurbitacins――a promising target for cancer therapy [J]. Int J Health Sci，2013，7（1）： 77.

[8] Tian R R，Chen J C，Zhang G H，et al. Anti-HIV-1 activities of hemslecins A and B[J]. Chin J Nat Med，2008，6（3）： 214.

[9] 王遥，刘坤鹏，宋方茗，等. 雪胆素乙对小鼠淋巴细胞体外活化及增殖的影响[J]. 免疫学杂志，2013，29（3）： 190.

[10] 任帅，徐丽慧，曾龙辉，等. 雪胆素乙通过破坏微丝结构和促进p21Cip1表达抑制前列腺癌PC-3细胞的增殖[J]. 中国药理学与毒理学杂志，2012，26（6）： 835.

Study on in vivo pharmacokinetics of cucurbitacin injection in rats

XU Xiao-ting， DENG Zhi-peng， FAN Hui-xia， ZHONG Hao， YAO Qing-qiang

（1.Institute of Materia Medica， Shandong Academy of Medical Sciences， Ji′nan 250062， China；

2.School of Medicine and Life Sciences， Shandong Academy of Medical Science， University of Ji′nan， Ji′nan 250022， China；

3. Key Laboratory of Rare and Uncommon Diseases of Shandong Province， Ji′nan 250062， China）

[Abstract] To establish a method for the determination of cucurbitacin in plasma samples， in order to study the in vivo pharmacokinetic characteristics of cucurbitacin in rats. Rats were intravenously injected with cucurbitacin. With diphenhydramine as the internal standard（IS）， the plasma concentrations of cucurbitacin in rat plasma at different time points were determined by liquid chromatography tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）. With electrospray ionization source， the positive ion detection in the multiple reaction monitoring mode was conducted to determine the ion-pairs for target compound and IS were m/z 503.2/113.1 and m/z 256.0/167.2， respectively. Agilent ZOBAX SB-C18 column （2.1 mm×50 mm， 1.8 μm） was adopted and eluted with methanol and 0.1% formic acid（55∶45）， and the flow rate was 0.2 mL・min-1. DAS 2.0 software was applied to fit the blood concentration and calculate corresponding pharmacokinetic parameters. The rats were intravenously injected with cucurbitacin at the concentration of 3.0 mg・kg-1. The target blood quality concentration show good linear relations within the range of 10.5-3 150 μg・L-1（R2=0.996）， the lower limit of the standard curve was 10.5 μg・L-1， and the signal to noise ratio S/N=12. Intra- and inter-day precisions RSD was less than 6.9% and 14%， respectively； The accuracy RE ranged between 0.20% and 3.7%； The extraction recoveries ranged between 92.7% and 97.1%. Regarding the pharmacokinetic parameters of tail intravenous injection of cucurbitacin， AUC 0-t was （811.615±111.578） μg・h・L-1， t1/2 was （1.285±1.390） h， CL was （3.627±0.487） L・h・kg-1， and Vd was （6.721±7.429） L・kg-1. In this study， researchers established a simple， accurate， sensitive and highly specific method for determining the blood concentration of cucurbitacin， and reported the in vivo pharmacokinetic characteristics of cucurbitacin in rats for the first time.

[Key words] cucurbitacin； LC-MS/MS； pharmacokinetic characteristics

doi：10.4268/cjcmm20141136