CaMKIV在免疫细胞中的作用

基金项目：福建省自然科学基金（C0710017）

作者单位：350001 福建医科大学附属内分泌研究所

通讯作者：游捷

【摘要】 钙调蛋白激酶（CaMK）IV是Ca2+信号转导过程中的一个关键激酶，主要表达在神经组织和免疫系统。研究表明，在经过一系列级联反应激活后，CaMKIV转位至细胞核，通过调节转录因子CREB、MEF2及AP-1等活性，参与调节T细胞发育和激活，树突状细胞分化和存活，以及骨髓造血干细胞的维护。新近关于骨免疫学方面的研究显示，CaMKIV参与调节免疫应答，本文针对部分表达该蛋白的免疫细胞，探讨CaMKIV在免疫炎症中的作用。

【关键词】 钙调蛋白激酶IV； 炎症反应； T淋巴细胞； 树突状细胞

Ca2+是一个通用而普遍存在的第二信使，广泛参与各种基础细胞进程，钙调蛋白（CaM）是Ca2+的一个主要受体，在所有真核细胞中表达。Ca2+与CaM结合形成复合体，使得CaM内部构象改变，进而可与许多不同靶酶相互作用，这些靶酶中较重要的是钙调蛋白激酶（CaMKs）家族，包括磷酸化酶激酶、肌球蛋白轻链激酶（MLCK）、CaMKⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ［1］。CaMKs家族目前研究较多的是CaMK Ⅱ和Ⅳ，主要在神经组织和免疫系统。

1 CaMKIV概述

1.1 基因和蛋白 CaMKIV主要表达于脑组织和胸腺，脾脏、卵巢和也有少量表达。在免疫系统中表达于T细胞、树突状细胞、造血干细胞，在B细胞及单核细胞中未见报道。编码CaMKIV的基因由42 kb DNA组成，包括12个外显子和11个内含子，由于剪接差别和转录起始位点的不同，能够产生多种mRNA。CaMKIV的分子量约为60 KDa，基本结构包括一个N-末端激酶区域，一个自动调整区域和一个重叠的CaM结合区域。CaMKIV蛋白包括α、β两种亚型，后者包含一个由28个氨基酸残基组成的N-末端扩展，其余结构基本相同［2］。

1.2 激活过程 在细胞质中CaMKIV是一个由钙调蛋白激酶激酶（CaMKK）和蛋白磷酸酶2A（PP2A）组成的复合体，是无活性的。当胞内Ca2+浓度增加时，部分Ca2+结合CaM，然后Ca2+/CaM复合物结合CaMKIV，由于Ca2+/CaM的结合位点与PP2A相同，故而取代PP2A，并且使得CaMKIV构象改变，进而使CaMKIV具备最基础的激酶活性，暴露出可被CaMKK磷酸化的活性环。CaMKK磷酸化Thr200（在鼠类为Thr196）位点，使CaMKIV完全激活，之后Ser12-Ser13位点自发磷酸化，称为“自主激活”［3］。只有自主激活的CaMKIV才能转位至核内，参与基因转录的调控。此后，PP2A在细胞核内重新结合CaMKIV，并使活性环上的苏氨酸残基去磷酸化。这种无活性的CaMKIV从细胞核进入胞质，完成一次活性循环，称为级联反应［4］。

1.3 介导的转录调节 在免疫系统中，细胞内CaMKIV大部分效应与这些转录因子的调节有关，包括cAMP-反应元件-结合蛋白（CREB）和它的辅激活因子CBP以及肌细胞增强因子2（MEF2）。CREB是一种遍在而保守的转录因子，可结合相同的cAMP效应元件（CRE），它的转录激活主要是通过S133位点的磷酸化来调节的，并使转录辅激活因子CBP募集。磷酸化的CREB-CBP复合物同基础转录结构相互作用启动RNA合成［5］。MEF2存在于一些肌肉-特殊基因的启动子中，最初被认为是肌形成的一个主要调节者。Blaeser等［6］研究表明，CaMKIV介导的信号转导至MEF2，能激活T细胞Nur77启动子。在静止胸腺细胞，MEF2募集一个家族的转录抑制物，包括Cabin1和组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）-4、-5和-7。这些抑制物作为组蛋白脱乙酰基酶而改变染色质结构和沉默启动子活性。Ca2+流入，Ca2+/CaM移走抑制物，使MEF2结合辅激活因子（如P300），进而启动靶基因转录。

2 CaMKIV在T淋巴细胞中的作用

2.1 CaMKIV与T细胞发育 Krebs等［7］研究显示，CaMKIV在小鼠胸腺的胚胎发生过程中起调节作用。胚胎发育的前16 d CaMKIV存在于整个胸腺，第18天急剧增加，此时CaMKIV的水平与小狗出生后第一天的表达水平相当。对小鼠胚胎的原位杂交研究显示，在发育12.5 d前CaMKIV mRNA在胸腺原基的高表达，13.5 d后定位模式变得弥散，但在胸腺内可被检测到，在胸腺发育的剩余时段则持续高表达，观察到的信号与小狗出生后第一天的切片相当［8］。CaMKIV在成熟胸腺亚型中的表达各不相同，在胸腺细胞从CD4-CD8-的第一阶段（DN1）分化至DN3的过程中CaMKIV表达不断增加，在DP（CD4+CD8+）T细胞中，CaMKIV水平与细胞表面TCRαβ的表达相关，在大部分成熟DP细胞和SP（CD4+或CD8+）细胞中表达逐渐减少［7］。

Anderson等［9］发现无活性的CaMKIV在胸腺细胞中表达使得胸腺体积增大，细胞构成增多，离体培养的存活率明显下降。这种胸腺细胞在伊屋诺霉素和佛波酯十四烷酸刺激下不分泌IL-2及上调CD25的表达，原因可能与早期信号通路中CREB磷酸化显著减少和早期快反应基因表达等相关。在这些动物中，观察到SP细胞百分率缓慢下降，伴随着DP细胞平行增加，表明CaMKIV在DP细胞转化为SP细胞的过程中起作用。这个现象可能是胸腺细胞发育过程中CaMK级联产生效应的外在表现，因此CaMKIV可能是DP细胞选择发育中信号机制的一个主要成分。这个研究揭示CaMKIV在DP细胞选择发育过程中的一种特殊作用，并且在形成成熟胸腺细胞T细胞受体（TCR）的所有组成成分的过程中也起特定作用。

2.2 CaMKIV与T细胞的活化 Hanissian等［10］通过TCR触发诱导Ca2+依赖和自发激活的CaMKIV快速增加，紧接着快速返回至基线，说明这激活和失活循环是简短且受紧密调控的。Yu等［11］在鼠EL4胸腺瘤细胞系中发现，CD3和CD28介导的信号通过一种与CaMKIV有关的机制促进CREB-CBP相互作用。在这个模型中CD28交联激活CaMKIV，从而使CREB磷酸化和募集CBP。Park等［12］提出，TCR刺激使CaMKIV的最大活化需要酶（包括CaMKK）的级联。提供的直接证据就是克隆人和鼠CaMKKβ，并在Jurkat细胞的氨基酸T200中证明这种酶使CaMKIV磷酸化的能力，结果是CaMKIV的活性明显增加。而且通过提高细胞内Ca2+含量CaMKKβ的活性也明显增加。因此Park认为CaMKK的激活比CaMKIV更需要Ca2+的高浓度或者一个不同的Ca2+库。对Ca2+的不同需求能使CaMKIV通过Ca2+/CaM单独在某种环境有选择的短暂的活化，或者通过被CaMKK磷酸化应答其它刺激信号而产生更强的激活。

IL-2对于初始T细胞的克隆扩增以及Treg细胞的增殖和存活都是非常重要的。IL-2基因的最大诱导需要可诱导转录因子AP-1。Ho等［13］提出，CaMKIV通过一种涉及AP1的机制控制IL-2启动子的活性，在成熟CD4+T细胞中起着控制CREB激活的作用。虽然在初始T细胞和胸腺细胞中，CaMKIV对于CREB的磷酸化和IL-2分泌的诱导都是可有可无的，但是在CD4记忆亚型T细胞的激活过程起着关键作用。Pan等［14］发现MEF2在Jurkat细胞和一种鼠T细胞杂交瘤中调节IL2基因的转录。一个MEF2结合位点存在于IL2启动子，接近TATA盒，这个元件在静止性T细胞中被MEF2占有，起着调节Cabin1和组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）-4募集的作用。从IL-2启动子中移动MEF2位点或通过siRNA减少MEF2的表达，导致IL-2转录的明显减弱。Pan等［15］进一步研究发现，CaMKIV通过释放Cabin1介导抑制MEF2介导的转录，进而调节IL-2启动子中MEF2的转录活性。这是通过直接磷酸化Cabin1的C末端来为14-3-3产生一个停泊位点而实现的，14-3-3结合磷酰化Cabin1使核内Cabin1输出，使MEF2发挥其转录激活功能。CaMKIV介导的Cabin1的核输出可能是人T细胞激活过程所需要的一个重要部分。

3 CaMKIV与树突状细胞（DC）的存活

Illario等［16］研究发现，在人单核衍生DC的分化过程中CaMKIV不断蓄积，进而控制着CREB磷酸化和Bcl-2（凋亡调节蛋白家族，部分成员能抑制凋亡）蓄积。药理抑制剂和无活性CaMKIV的异位表达，降低暴露在LPS中DC的生存能力。Camk4基因剔除小鼠的淋巴组织中DC数量减少，而且活体内脾脏暴露于LPS中不能蓄积成熟DC。虽然离体camk4-/- DC能够获得成熟细胞的表现型，在LPS刺激下也能释放常规量的细胞因子，但是它不能蓄积pCREB、Bcl-2和Bcl-xL，因此不能存活。CaMKIV剔除小鼠中转基因表达Bcl-2，在LPS刺激时DC存活能力完全恢复。TLR激动剂促进DC存活主要是通过控制Bcl-2家族蛋白蓄积的时间，因此可以说Bcl-2是DC寿命和适应性免疫应答强度持续的“分子时钟”［17］。当离体的DC激活“Bcl-2分子时钟”，发生自发凋亡时，TLR4转导信号修正BcL-2的丢失，并且延长已活化的DC的寿命［16］。

4 CaMKIV级联反应在造血干细胞中的作用

Kitsos等［18］研究显示，CaMKIV在造血祖细胞及干细胞中表达，并且因为三种表面标记的状态（c-Kit+，Sca-1+，Lin-/low）而称为KLS细胞。Camk4-/-小鼠的骨髓中仅含少量的KLS细胞并且功能缺陷，血液中白细胞含量也下降。KLS细胞数量降低可能与凋亡增加有关，而KLS细胞中缺乏CaMKIV与CREB S133位点磷酸化降低相关。Camk4-/- KLS细胞中数目下降的还有CREB结合蛋白CBP，说明CaMKIV对于KLS细胞中CREB/CBP通路的激活很重要，Bcl-2被认为可能是CREB/CBP的一个下游靶点。在Camk4-/-小鼠KLS细胞中，Bcl-2 mRNA和蛋白质下降，这在CaMKIV、磷酸化CREB、CBP和Bcl-2之间建立了一个清楚的关系。在Camk4-/- KLS细胞中重新表达CaMKIV，能恢复磷酸化CREB、CBP及Bcl-2的表达水平。相似的，在Camk4-/- KLS细胞中表达野生型CaMKIV，能纠正它们的增殖过度和凋亡异常。这些研究显示CaMKIV在造血干细胞的维护中起着重要作用，也暗示在哺乳动物中阻断这些酶可能有免疫抑制的作用［2］。

5 问题与展望

综上所述，这些有关CaMKIV的研究显示，这条信号途径广泛参与免疫反应和炎症应答的各级进程，与控制这些进程的分子机制密切相关。新近研究显示，CaMKIV通过控制破骨细胞和树突状细胞的分化存活，介导骨骼与免疫系统之间的相互作用，与炎性骨疾病（类风湿性关节炎，牙周病和骨髓炎）的发生密切相关［19］。抑制CaMKIV能抑制细胞因子的产生和辅刺激分子的表达，减缓有狼疮倾向小鼠的疾病进程［20］。Sugiyama等［21］发现CaMKIV的异常调节是高糖导致的胰腺β细胞功能缺陷的重要因素，CaMKIV还参与exendin-4诱导的GLUT2及GK基因转录，进而影响胰岛素的分泌［22,23］。因此，在免疫细胞中关于CaMKIV的研究带来引人入胜的前景，将为这些免疫炎性疾病的防治提供新的思路。

参 考 文 献

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（收稿日期：2011-02-24）