基于多指标成分同时检测的六味地黄浓缩丸溶出度测定

[摘要]以没食子酸、马钱苷、芍药苷、丹皮酚的含量为指标，筛选溶出度测定条件，建立六味地黄浓缩丸多指标成分的溶出度测定方法，计算并绘制累积溶出曲线，再通过相似因子（f2）比较不同厂家产品的溶出度差异。结果显示，最佳的溶出度测定条件为采用桨法，以250 mL 0.1 mol・L-1盐酸为溶出介质，转速100 r・min-1。不同厂家六味地黄浓缩丸中4种成分的溶出曲线相似因子f2大多小于50，表明不同厂家六味地黄浓缩丸溶出度存在显著性差异，为完善六味地黄浓缩丸的质量评价提供科学依据。

[关键词]六味地黄浓缩丸；多成分；溶出度；相似因子

[收稿日期]2013-08-08

[基金项目]江西省卫生厅中医药科研计划项目（2012A033）；江西省教育厅科研项目（GJJ13584）；江西中医药大学重点学科青年教师培养计划项目（2012jzzdxk020）

[通信作者]*廖正根，教授，研究方向为中药制剂及新剂型，Tel：（0791）87118658，E-mail：

[作者简介]罗云，博士，讲师，Tel：（0791）87119011，E-mail：药物溶出度与原料药、辅料的质量优劣、生产工艺等因素密切相关，其差异是临床疗效不一的原因之一，科学合理的溶出度质量标准能体现口服固体制剂的内在品质[1-2]。六味地黄浓缩丸收载于2010年版《中国药典》一部，为滋阴补肾常用中成药，由熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、泽泻、茯苓等6种中药饮片制成，成分十分复杂、药效物质基础不十分明确，加之生产厂家众多、所用药材原料质量不同、各厂家制法虽按照药典标准但工艺参数可能不同，导致质量参差不齐[3]。现行的六味地黄浓缩丸质量标准仅以溶散时限作为其溶解释放的控制指标[4]，尚无溶出度检查，而目前多以其中某1～2个化学成分为指标进行溶出度研究[1，5]，这与中药多成分、多靶点、多途径的作用特点不相符。因此，为提高和完善其质量标准，保证其临床疗效，有必要建立符合中药特点的六味地黄浓缩丸溶出度测定方法。本研究在前期实验结果的基础上[6]，以没食子酸、芍药苷、马钱苷、丹皮酚4种主要成分为指标，建立基于多指标成分同时检测的六味地黄浓缩丸溶出度测定方法，并比较不同厂家六味地黄浓缩丸的溶出度差异，为科学合理地制定其溶出度质量标准提供研究基础和方法。

1材料

ZRS-8G智能溶出试验仪（天津天大天发科技有限公司）；Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；1/10万BT25S电子分析天平，1/1万BSA124S电子分析天平（德国Sartorius公司）；JK-5200型超声波清洗器（功率200 W，频率40 kHz，合肥金尼克机械制造有限公司）。没食子酸、马钱苷、芍药苷、丹皮酚（中国食品药品检定研究院，纯度分别为90.1%，99.2%，96.5%，100%，批号分别为110831-200803， 111640-201005，110736-201035，110708-200506）。六味地黄浓缩丸（厂家A，批号0030809；厂家B，批号10J410；厂家C，批号100831；厂家D，批号1005002；厂家E，批号1007167，1009313，1012322；厂家F，批号10010009；厂家G，批号201007014）。色谱纯乙腈（德国Merck公司）；双蒸水（自制），其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1HPLC测定没食子酸、芍药苷、马钱苷和丹皮酚的含量[6]

2.1.1对照品溶液的制备分别精密称取没食子酸7.20 mg，马钱苷4.73 mg，芍药苷3.74 mg，丹皮酚7.12 mg，置10 mL量瓶，加入50%甲醇，超声使溶解，定容至刻度，即得混合对照品储备液，取1 mL，置50 mL量瓶，加入50%甲醇，定容至刻度，混匀，即得混合对照品溶液（每1 mL含没食子酸0.013 0 mg，马钱苷0.009 4 mg，芍药苷0.007 2 mg，丹皮酚0.014 2 mg）。

2.1.2供试品溶液的制备取六味地黄浓缩丸，精密称定。按照《中国药典》2010年版二部附录XC溶出度测定法第三法（小杯法），溶出介质为250 mL经脱气处理后的0.1 mol・L-1盐酸，采用桨法，转速100 r・min-1，温度（37±0.5）℃，于10，20，30，45，60，90，120 min分别取样2 mL（同时补加同温溶出介质2 mL），立即用0.45 μm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

2.1.3色谱条件Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.015%磷酸溶液（B），梯度洗脱，0～3 min，5% A；3～10 min，5% ～10% A；10～15 min，10% A；15～43 min，10%～45% A；43～50 min，45%～100% A。流速1.0 mL・min-1；检测波长238 nm；柱温35 ℃。

2.1.4系统适用性试验按2.1.3项下色谱条件进行检测，以没食子酸计算理论塔板数大于3 000，分离度大于1.5。对照品溶液及供试品溶液的色谱图见图1。

a. 混合对照品溶液； b. 溶出供试品溶液； 1. 没食子酸； 2. 马钱苷； 3. 芍药苷； 4. 丹皮酚。

图1对照品溶液和六味地黄浓缩丸HPLC图

Fig.1HPLC chromatograms of the reference solution and Liuwei Dihuang concentrated pills

2.1.5线性关系考察精密吸取混合对照品溶液0.5，1，2，4，6，8，10 μL，按2.1.3项下色谱条件分别进样测定。以峰面积对进样量（μg）进行回归，得线性方程，没食子酸：Y=740.4X+5.1（r=0.999 9），马钱苷：Y=1 698.5X+3.9（r=0.999 9），芍药苷：Y=1 192.5X-2.0（r=0.999 9），丹皮酚：Y=1 709.3X+5.2（r=0.999 9）。结果表明没食子酸、马钱苷、芍药苷、丹皮酚分别在0.006 5～0.130 μg，0.004 7～0.094 μg，0.003 6～0.072 μg，0.007 1～0.142 μg线性关系良好。

2.2溶出条件的考察

2.2.1溶出介质的选择常用的溶出介质有蒸馏水、0.1 mol・L-1盐酸溶液及不同pH的缓冲液等，本实验比较了浓缩丸以蒸馏水和0.1 mol・L-1盐酸作为溶出介质的溶出度。参照《中国药典》2010年版二部附录XC溶出度测定法，分别以900 mL脱气蒸馏水及0.1 mol・L-1盐酸为溶出介质，温度（37±0.5） ℃，转速100 r・min-1。取六味地黄浓缩丸6丸，称定质量，分别投入6个溶出杯内，立即启动旋转并开始计时，于10，15，30，45，60，90，120 min 各取样2 mL（同时补加同温溶出介质2 mL），立即用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液，HPLC测定没食子酸、马钱苷、芍药苷、丹皮酚4种主要成分含量，计算成分累积溶出率，绘制累积溶出曲线，结果见图2。以0.1 mol・L-1盐酸为溶出介质，溶出速度较快，4种成分接近完全溶出，且0.1 mol・L-1的盐酸溶液更接近于人体胃部环境，因此选择0.1 mol・L-1盐酸作为溶出介质。但在此条件下，由于溶出体积大，刚开始时溶出少，药液浓度较低，峰面积较小，积分不准，导致数据波动较大，因此，溶出介质的体积有待进一步考察。

2.2.2溶出介质体积的选择在优选出溶出介质为0.1 mol・L-1盐酸的基础上，比较六味地黄浓缩丸在不同体积溶出介质中溶出的差异，根据溶出杯的大小考察了2种体积250，900 mL。转速、溶出介质温度条件等其他条件同2.2.1项，测定没食子酸、马钱苷、芍药苷、丹皮酚4种主要成分含量，计算成分累积溶出率，绘制累积溶出曲线，结果见图3。4种成分在250，900 mL的0.1 mol・L-1盐酸累积溶出差别不大且都能完全溶出，250 mL溶出介质体积小，药液浓度较大，测得峰面积较大，计算结果更准确，因此，确定溶出介质体积为250 mL。

2.2.3溶出方法的选择以250 mL 0.1 mol・L-1盐酸为溶出介质，比较桨法、篮法所测溶出度的差别。根据《国家药品标准工作手册》对溶出度的检查与指导原则，桨法以50 r・min-1为主，其最能体现人体正常肠胃蠕动状态，故选用50 r・min-1作为测定转速，其他条件同2.2.1项。测定没食子酸、马钱苷、芍药苷、丹皮酚4种主要成分含量，计算成分累积溶出率，绘制累积溶出曲线，结果见图4。4种主要成分桨法溶出速度和累积溶出度均大于转篮法，故选择桨法。《中国药典》2010年版一部规定浓缩丸溶散时限为2 h，但桨法在50 r・min-1下2 h内未达到完全溶出，因此，桨法转速有待进一步考察。

a. 没食子酸； b. 马钱苷； c. 芍药苷；d. 丹皮酚（图3～7同）。

图24种成分在不同溶出介质中的累积溶出曲线

Fig.2Accumulation dissolution curves of four main components in different medium

图3不同体积0.1 mol・L-1盐酸中4种成分累积溶出曲线

Fig.3Accumulation dissolution curves of four main components in different volume of medium

2.2.4转速的选择以250 mL 0.1 mol・L-1盐酸为溶出介质，考察转速为50，75，100 r・min-1对4种成分溶出的影响，其他条件同2.2.1项，测定没食子酸、马钱苷、芍药苷、丹皮酚4种成分含量，计算成分累积溶出率，结果见图5。按《中国药典》要求，普通制剂45 min内的溶出量达到标示量的70%，实验结果表明，只有在转速为100 r・min-1时，4种成分的溶出才能达到要求，故选择转速为100 r・min-1。

图4不同测定方法4种成分的累积溶出曲线

Fig.4Accumulation dissolution curves of four main components measured by different method

图5不同转速下4种成分的累积溶出曲线

Fig.5Accumulation dissolution curves of four main components by different rotation speed

综上所述，确定最佳的溶出度测定条件为：以250 mL经脱气处理的0.1 mol・L-1盐酸为溶出介质，桨法，温度（37±0.5） ℃，转速100 r・min-1。

2.3同一厂家不同批号六味地黄浓缩丸溶出度的测定

取3批厂家E的六味地黄浓缩丸，按2.2项下确定的溶出度测定条件制备供试品溶液，按2.1项下的方法测定没食子酸、马钱苷、芍药苷、丹皮酚4种主要成分含量，计算成分累积溶出率，绘制累积溶出曲线，结果见图6。

图6同一厂家不同批号六味地黄浓缩丸4种成分累积溶出曲线

Fig.6Accumulation dissolution curves of four main components of different batches from the same factory

采用相似因子法（f2）比较3批厂家E的六味地黄浓缩丸没食子酸、马钱苷、芍药苷、丹皮酚溶出的差异，结果显示，对于没食子酸、马钱苷、芍药苷、丹皮酚的溶出，3批六味地黄浓缩丸之间的f2均大于0.5。可见，同一厂家不同批号六味地黄浓缩丸中4种成分的溶出度无显著性差异，表明该厂家的产品质量比较稳定。

2.4不同厂家六味地黄浓缩丸溶出度的测定

取不同厂家六味地黄浓缩丸，按2.2项下确定的溶出度测定条件制备供试品溶液，按2.1项下的方法测定没食子酸、马钱苷、芍药苷、丹皮酚4种主要成分含量，计算成分累积溶出率，绘制累积溶出曲线，结果见图7。

采用相似因子法（f2）比较不同厂家六味地黄浓缩丸没食子酸、马钱苷、芍药苷、丹皮酚溶出的差异，结果显示，对于没食子酸的溶出，厂家D与其他6个厂家、厂家G与其他6个厂家、厂家A与厂家F的f2均小于0.5，其他厂家之间的f2均大于0.5；对于马钱苷的溶出，厂家D与其他6个厂家、厂家G与其他6个厂家、厂家A与厂家C和厂家F、厂家E与厂家C的f2均小于0.5，其他厂家之间的f2均大于0.5；对于芍药苷的溶出，厂家D与其他6个厂家、厂家E与除厂家G的其他5个厂家、厂家G与除厂家E的其他5个批号的f2均小于0.5，其他厂家之间的f2均大于0.5；对于丹皮酚的溶出，除了厂家A与厂家D，厂家B与厂家C，厂家E与厂家G，厂家F与厂家B和厂家C的f2均大于0.5，其他厂家之间的f2均小于0.5。可见，不同厂家六味地黄浓缩丸中4种成分的溶出曲线相似因子f2大多小于50，溶出度存在较显著性差异。

此外，还采用相似因子法（f2）研究不同厂家六味地黄浓缩丸4种成分溶出的同步性，结果表明，厂家A中没食子酸与马钱苷具有溶出同步性，而其他成分之间无同步性；厂家D中丹皮酚与没食子酸和马钱苷不具有溶出同步性，而其他成分之间具有同步性；厂家B，C，E，F，G中4种成分具有溶出同步性。

3讨论

目前，中成药是中医用药的主要形式之一，也是非处方药的重要组成部分，不同厂家生产的同一品种之间质量的差异，直接影响临床疗效[5]。虽然有的中药中有效成分含量高，但溶出少，不能发挥应有的疗效，因此还需建立科学合理的溶出度质量标准来衡量其内在品质[7]。本研究以没食子酸、芍药苷、马钱苷、丹皮酚4种主要成分为指标，建立了基于多指标成分同时检测的六味地黄浓缩丸溶出度测定方法，符合中药多成分、多靶点、多途径的作用特点，为科学合理地制定其溶出度质量标准提供研究基础和方法。

本研究还比较了不同厂家六味地黄浓缩丸的溶出度差异，结果显示，7个厂家生产的六味地黄浓缩丸中4种成分溶出度存在较显著的差异。虽然各厂家均按照《中国药典》所载制法制备六味地黄浓缩丸，但是工艺参数可能不一致，如饮片粉碎粒度、药粉混合均匀度、提取浓缩过程工艺参数、浸膏的相对密度、软材的制备方法、丹皮酚的加入方式、抛光的工艺参数、干燥的方式、温度和时间等[5]，这些工艺参数的不同都将导致六味地黄浓缩丸溶出度的差异，从而影响其临床疗效。

体外溶出度试验在一定程度上可以预测药物的体内溶出状况[8-9]，是证明药物体内释放特性的一种简单、廉价而不失严谨的实验室检测方法[2]。复方中药体外溶出同步至关重要，只有在体内同步释放、吸收才能达到复方中药相辅相成、相互协同的目的[10]。本研究比较了不同厂家六味地黄浓缩丸中4种成分的溶出同步性，结果显示，厂家B，C，E，F，G中4种成分具有溶出同步性。

六味地黄浓缩丸中还有毛蕊花糖苷（熟地黄）、尿囊素（山药）、23-乙酰泽泻醇B（泽泻）、茯苓酸（茯苓）等化学成分，但可能由于这些成分在饮片中的含量不高或对热不稳定，经过提取、浓缩、干燥等复杂的制备工艺后，在六味地黄浓缩丸中的含量较低而未能检出，下一步将采用液-质联用等更灵敏的检测方法进行研究。此外，为了制定更为科学合理的溶出度质量标准，还有必要进一步研究体内-体外的相关性。

图7不同厂家六味地黄浓缩丸4种成分累积溶出曲线

Fig.7Accumulation dissolution curves of four main components of different factory

[参考文献]

[1]程荷珍，王桂红，王萍.六味地黄丸（浓缩丸）溶出度的测定[J].中成药， 2001， 23（5）： 380.

[2]谢沐风. 如何科学、客观地制订溶出度试验质量标准[J].中国医药工业杂志， 2012， 43（3）： A23.

[3]白林，方旬，任. 不同厂家六味地黄丸质量比对分析[J].中国药物应用与监测， 2011， 8（5）： 278.

[4]中国药典.一部[S].2010：附录6.

[5]鲜洁晨，张宁，冯怡. 六味地黄丸质量差异分析[J].中成药， 2009， 31（6）： 882.

[6]罗云，郝伟伟，王洁，等. 高效液相色谱法测定六味地黄浓缩丸特征图谱及4种主要成分的含量[J].中国医院药学杂志， 2012， 32（10）： 748.