自体细胞因子诱导杀伤细胞治疗肝硬变的临床疗效研究

【摘要】 目的 观察自体细胞因子诱导杀伤细胞(CIK细胞) 治疗HBV DNA 阳性肝硬化患者的近期疗效。方法 CIK细胞在体外培养前后以及回输体内后检测CD+3、CD+3CD+4、CD+3 CD+8、CD+3 、CD+56、CD+25细胞以及mDC 和pDC。治疗肝硬化患者,比较治疗前后病毒学指标及肝脏功能的变化。结果 培养结束以及回输体内后, CD+3细胞、CD+3 CD+8细胞、CD+3 CD+8细胞较培养前显著升高,mDC 和pDC 在回输后也明显增高,肝脏功能较治疗前有所好转。所有患者均能耐受治疗。结论 CIK细胞可明显提高免疫效应细胞数量,具有一定的抗病毒效应作用,毒副作用低。

【关键词】 CIK细胞;乙型肝炎;肝硬化;疗效

【Abstract】 Objective To observe the autologous cytokine-induced killer cells (CIK cells) in the treatment of chronic HBV DNA-positive patients with cirrhosis of the liver function. MethodsBefore and after CIK cells in vitro and in vivo detection of transfusion CD+3, CD+3 CD+4, CD+3 CD+8, CD+3, CD+56 cells and mDC, and pDC. Treatment of patients with liver cirrhosis compared before and after treatment virological indicators and liver function changes.Results After culture and reinfusion in vivo, CD+3 cells, CD+3 CD+8 cells, CD+3, CD+56 cells, cultured cells were significantly elevated, mDC and pDC significantly increased after transfusion, liver function had improved compared with before treatment . All patients could tolerate the treatment. Conclusions CIK cells can significantly increase the number of immune effector cells, with a certain anti-viral effect of the role of low toxicity. There are no aggravating liver damage, liver function and for a certain degree of improvement.

【Key words】 CIK cells;Hepatitis B;Hepatocirrhosis

在HBV 持续复制的肝硬化患者中,肝脏炎性纤维化持续进展并且坏死特别严重。由于a-干扰素的不良反应和拉米夫定的高耐药病毒突变,对这类患者还没有很有效的、可耐受的抗病毒治疗。CIK细胞作为高免疫活性细胞已越来越广泛地用于HBV 感染所致原发性肝癌和抗HBV 治疗,其治疗时可诱导激活特异性细胞免疫反应。用于治疗慢性乙型肝炎报道也有一定疗效[1],本治疗血清HBV DNA 阳性肝硬化的近期临床疗效较好,特报道如下。

1 研究对象

1.1 一般资料 66例患者均为住院患者,其中男59 例,女7 例,年龄36～67 岁(47.2岁)。所有病例均诊断为肝硬化,诊断符合2000 年西安学术会议制定的病毒性肝炎防治方案诊断标准[2],全部病例HBsAg、HBcAg、HBV DNA 阳性持续6 个月以上,HBeAg 阳性42例,阴性24例,其中肝功能正常的5例,肝功能异常的61例。ALT 波动于正常至5倍,TBiL ≤51μmol/L,肝脏功能childpugh 评分为A或B级。

1.2 排除病例 肝性脑病、消化道出血、重度感染或大量腹水等严重并发症,半年内未使用过其他抗病毒药和其他免疫调节剂,其他病毒感染、酒精性、药物性肝病。

2 治疗方法与检测项目

2.1 CIK 细胞的培养 在患者签署知情同意书后,使用采血机(Spectra v 611) 采集患者外周血单个核细胞,每例患者采集细胞数约(1～4) ×109,容积40～70 ml 。在符合GMP 实验室条件下,用无血清培养基调整细胞浓度至(1～2) ×106 ml,置于透气性培养袋中,于不同时间加入一定剂量的rhIFNr,IL-2、antiCD3 mAb (美国BD公司) 等各种细胞因子,37℃,5%CO2悬浮培养。

2.2 CIK细胞悬液的制备及回输,每次取CIK细胞悬液的1/3体积,离心、洗涤和重悬浮后制备成容积为400～500 ml的CIK细胞悬液,将诱导培养成的CIK细胞分3次于培养的第10、13、15天回输给患者。

2.3 中医辨证 活血破积,攻坚祛瘀,益肝保肝。药用:黄芪、党参、薏仁、淮山药、穿山甲、龟板、丹参、板蓝根、茵陈、丹皮、栀子、鸡内金、三七、煅瓦楞等。临症加减。

2.4 检测项目

2.4.1 CIK细胞体外培养前后以及回输体内后细胞表型的检测:在体外培养前后以及回输体内2周左右采集肝素抗凝血5 ml,Ficoll梯度离心法分离淋巴细胞,流式细胞仪(美国BD公司)检测CD+3、CD+3CD+4、CD+3、CD+8、CD+3、CD+56、CD+25细胞,同时在CIK治疗前后检测血液mDC和pDC。

2.4.2 治疗前后病毒学标志及肝脏功能的检测 全部病例在治疗前以及治疗后3个月采用ELISA法(试剂盒购自深圳达安公司)检测HBsAg、抗HBs、HBeAg、抗HBe、抗HBc,荧光定量PCR检测HBV DNA滴度,同时检测肝脏功能。

2.5 不良反应 在治疗过程中常规检测血常规、肾脏功能、B超及心电图等,并观测患者不良反应。

2.6 疗效判定 有效:治疗后HBV DNA转阴;显效:HBV DNA滴度下降大于2个log级;无效:HBV DNA无变化或HBV DNA下降不超过2个log级。

2.7 统计学方法 两组数据比较采用配对t检验。

3 结果

3.1 培养前后以及回输体内后CIK细胞表型变化特点在培养过程中及回输体内后使用流式细胞仪对CD+3、CD+3CD+4、CD+3 CD+8、CD+3 、CD+56、CD+25细胞进行了测定和分析。各类细胞表型的比例随培养时间变化而改变。在培养结束以及回输体内后, CD+3细胞、CD+3 CD+8细胞、CD+3 、CD+56细胞比例均较培养前显著升高( P< 0.05)。CD-25细胞略有升高,而CD-3、CD-4细胞的比例变化不明显。

3.2 CIK细胞治疗前后DC亚群的变化 分析了DC亚群在CIK细胞治疗前后的变化。治疗后mDC 和pDC 均较治疗前有明显增高(0.54 ±0.18 vs0.70 ±0.29; 0.26 ±0.13 vs 0.41 ±0.25),与治疗前相比,a P< 0.05。

3.3 应答反应 66例患者经CIK细胞治疗后3 个月有26例患者HBV DNA 阴转,有效率为39.4 %,8例患者HBV DNA 拷贝数下降大于2 个log,显效率为12.1 %,总有效率达51.5%。42例HBeAg 阳性患者中,有31例阴转,阴转率为73.8 %,但其中仅有4例出现HBeAb 转换。

3.4 CIK细胞治疗对肝脏功能的影响 CIK细胞治疗后3个月,患者肝脏功能指标(ALB、TBIL 、ALT、AST) 均较治疗前有所好转,但ALP 较治疗前无明显变化(表1)。

3.5 不良反应 免疫活性细胞回输后患者可出现一过性类流感样症状, 如发热( 体温37.5℃～39.5℃),轻度头痛、乏力、关节酸痛等,可自行缓解,所有患者均能很好耐受治疗。肾脏功能、血常规以及心电图检测均未见不良反应。

4 讨论

乙型肝炎病毒是引起肝硬化、肝癌的重要病原之一,目前虽然抗病毒治疗药物研究不断进展,但疗效仍不令人满意。慢性乙型肝炎患者中,肝硬化失代偿的年发生率约3%,5年累计发生率约16%。失代偿期肝硬化的5 年病死率为70%～ 86%。经抗病毒治疗后HBeAg 血清转换,HBV DNA 持续转阴和ALT 持续正常者的生存率较高[3]。干扰素在肝硬化患者中的应用受到限制,拉米夫定治疗虽然HBV DNA 阴转率较高,随着用药时间的延长患者发生病毒耐药变异的比例增高,从而限制了其长期应用。部分病例在发生病毒变异后还可能出现肝功能急剧恶化[4]。LAK细胞和TIL细胞等过继性免疫治疗由于很难同时获得既具有高活性又具有充足数量的效应细胞,因此应用受到了限制[1]。CIK细胞是经多种细胞因子诱导培养的一群异质性杀伤细胞,可分泌IL-2、IL-6、IFN-γ等多种细胞因子,激活机体免疫系统,其抗病毒作用可能是多种细胞因子和抗体协同作用,通过促进T淋巴细胞高表达IL-2受体,产生大量IL-2使T淋巴细胞活化,提高机体的免疫功能。

CIK细胞中的主要效应细胞为CD+3 、CD+56细胞,其在正常人外周血中极少,仅1%～5%。在体外经多种细胞因子刺激培养后, CD+3 、CD+56细胞迅速增多,可较培养前升高1000 倍以上。CD+3 CD+8细胞也可从培养前的20 %上升到60%～80%[5]。本研究结果显示CIK细胞不论在体外培养过程中,还是在回输体内后, CD+3 CD+8细胞、CD+3 、CD+56细胞均明显增高。

另外,还观察到DC 在CIK细胞治疗后较治疗前有显著的增加。DC是体内最强的抗原呈递细胞,成熟的DC可高表达MHC分子、协同刺激分子和黏附分子从而刺激初始型T 细胞诱导初级免疫反应,同时通过分泌IL-12活化NK细胞,促进Thl型细胞因子IL-2、IFN-r 的分泌,因此DC 被认为是一种很强的天然佐剂诱导细胞毒性T细胞反应,CIK细胞治疗后诱导DC的增高也可能是其抗病毒作用的重要机制之一。

在用CIK细胞治疗HBV DNA 阳性的肝硬化患者后,总有效率可达51.5%,有39.4 %的患者阴转,而且HBeAg 的阴转率也较高,达73.8 %,但其中仅有4例出现HBeAb 转换。因此表明CIK细胞治疗具有一定的抗HBV作用,而且在治疗后,患者肝脏功能较治疗前明显好转,可能是在CIK细胞治疗后,患者体内病毒含量的减少可促进肝脏炎症减轻,功能恢复。另外,所有肝硬化患者均能耐受CIK细胞治疗,未见明显不良反应。另加中药调护,疗效更好。

本研究初步观察了CIK细胞治疗肝硬化患者的疗效,该项治疗操作过程较复杂、技术要求高、成本也较高,但具有效应细胞增殖活性高、低毒副作用、有一定的抗病毒效应等优点。

所以自体细胞因子诱导杀伤细胞(CIK细胞)是治疗HBV DNA阳性肝硬化患者的有效方法。

参 考 文 献

[1] Dudley ME, Wunderlich R, Robbins PF, et al. Cancer regressionand autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumorlymphocytes. Science,2002, 298 : 850-854.

[2] 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会.病毒性肝炎防治方案.中华肝脏病杂志,2000,8:249-250.

[3] Liaw YF, Sung JJ, Chow WC, et al.Lamivudine for patients with chronic hepatitis B and advanced liver disease. N Engl J Med,2004,351:1521-1531.

[4] Liaw YF, Chien RN, Yeh CT, et al. Acute exacerbation andhepatitis B virus clearance after emergence of YMDD motif mutationduring lamivudine therapy. Hepatology, 1999, 30 :567-572.

[5] Schmidt-Wolf GD, Negrin RS, Schmidt-Wolf IG. Activated T cellsand cytokine-induce CD+3 CD+56 killer cells. Ann Hematol,1997,74:51-56.