基于正交试验的野木瓜中反丁烯二酸提取工艺的优化

[摘要] 目的：采用高效液相色谱法，利用正交试验L9（34）探究野木瓜中有机酸的最佳提取工艺条件。方法：运用正交试验对贵州野木瓜干燥根茎的提取条件进行探究，采用HPLC测定反丁烯二酸的含量。结果：极差分析表明，在各提取条件中，对反丁烯二酸的含量影响的顺序是：溶剂种类>提取次数>提取时间>料液体积比；方差分析表明，溶剂种类的差异性大于其他三个因素。结论：运用正交试验得到野木瓜最佳提取工艺是：90%的乙醇提取3次，每次2 h，料液体积比8倍量较为合适，且各项考察结果均符合要求，提示该提取工艺切实可行，为野木瓜中反丁烯二酸的含量测定提供了实验依据。

[关键词] 野木瓜；正交试验；反丁烯二酸；高效液相色谱法

[中图分类号] R282.71 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2011）12（a）-077-03

Optimization of the extraction technics for fumaric acids from Starntonia chinensis DC. based on orthogonal test

HU Shuping, LIU Tongxiang, LIU Shijie

Institute of Chinese Minority Traditional Medical, Minzu University of China, Beijing 100081, China

[Abstract] Objective: To explore the best extraction conditions of fumaric acid in Starntonia chinensis DC. by using HPLC and orthogonal test L9(34). Methods: Orthogonal test was applied to probe the extraction process on dried leaf and stem of Starntonia chinensis DC. from Guizhou; HPLC was utilized to measure the fumaric acid content. Results: Range analysis showed that the extraction conditions on the content of fumaric acid was in the order: kinds of solvent > extraction times > extraction time > volume ratio of solid; variance analysis indicated that kinds of solvent had greater effects than other factors. Conclusion: The optimal condition of the orthogonal test is that, the solid dissolved in 90% ethanol, extraction lasted for 2 hours, 3 times, solid to liquid volume ratio of 8 is more appropriate and the results of method investigation comply with all requirements. The technique proves to be practical, which provides theoretical foundation for measuring the content of fumaric acid in Starntonia chinensis DC..

[Key words] Starntonia chinensis DC.; Orthogonal test; Fumaric acid; HPLC

野木瓜（starntonia chinensis DC.），常用名七叶莲，为木通科（Lardizabalaceae）野木瓜属植物，性温，味微苦，具有祛风止痛及舒筋活络等功效[1-2]。临床用于各种手术止痛、坐骨神经痛、腰椎骨质增生、跌打损伤等，疗效显著，且具有无耐药性、无成瘾性、毒副作用小的特点[3-4]，是卫生部公布的药食两用植物，全株具有较高的药用价值。原标准中有一个显微鉴别，但未见该药材质量标准研究的报道。为了探究野木瓜中反丁烯二酸的含量，本实验运用高效液相色谱法测定野木瓜中反丁烯二酸的含量，并进行方法学研究，为野木瓜的质量标准研究提供一定的实验数据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 600-2996高效液相色谱仪（美国Waters公司），Waters 2996检测器，Empower 色谱工作站；Milli-Q超纯水纯化系统（美国Millipore 公司）；Metiler Toledo AL104电子天平（瑞士Metiler公司）；KQ-500E型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司，功率500 W，频率40 kHz）。

1.2 试剂

反丁烯二酸对照品（购自中国药品生物制品检定所，批号：1541-200001）；甲醇、乙腈为色谱纯（美国Fisher Chemical），水为超纯水，磷酸等其余试剂均为分析纯。

1.3 实验药材

野木瓜购于安徽亳州药材市场，经北京中医药大学张贵君教授鉴定为木通科野木瓜属野木瓜Starntonia chinensis DC.的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 提取方法考察

分别以超声提取、回流提取进行考察，结果表明回流提取效果优于超声提取，同时回流提取是较传统、方便的提取方法，故选取回流提取方法。

2.2 因素水平的确定

参照文献[5]报道，并根据野木瓜药材的理化性质，提取工艺选取了对提取率影响较大的溶剂种类（A）、提取时间（B）、料液体积比（C）和提取次数（D）作为参考因素，以反丁烯二酸的含量为考察指标，选定L9（34）正交表进行试验。正交因素水平见表1。

表1 提取因素和水平

2.3 试验方法

取野木瓜药材，40目过筛，精确称取30 g，按照正交设计表进行试验。

2.4 HPLC法测定反丁烯二酸的含量[6-7]

2.4.1 色谱条件 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸（5∶95）；检测波长为215 nm；流速为1 ml/min；柱温为30℃；进样量均为20 μl。理论塔板数按反丁烯二酸峰计算不低于2 500，保留时间在8 min左右。反丁烯二酸色谱图显示，样品溶液的主峰保留时间与对照品一致，提示其他共存组分无干扰。见图1。

A.对照品溶液；B.供试品溶液；1.反丁烯二酸

图1 反丁烯二酸对照品和野木瓜样品溶液HPLC图谱

2.4.2 对照品溶液的制备 取反丁烯二酸对照品适量，精密称定，加色谱甲醇并稀释制成0.04 mg/ml溶液，过0.45 μm滤膜，即得。

2.4.3 供试品溶液的制备 取提取液，减压浓缩至约20 ml，用甲醇定容至100 ml，过0.45 μm滤膜，摇匀，即得。

2.4.4 测定方法 精密称取9份正交试验样品，制备成供试样品溶液，进行测定。吸取供试品溶液和对照品溶液各20 μl，注入HPLC色谱仪，记录峰面积，在相同条件下每个样品重复测定3次，取平均值。按外标法计算样品中反丁烯二酸的含量。

2.5 正交试验结果分析

采用L9（34）正交表进行试验，以反丁烯二酸的含量为检测指标，然后进行极差分析和方差分析。见表2、3。

表2 正交试验设计表及结果

表3 方差分析结果

极差分析表明，以反丁烯二酸的量为考察指标，各因素对反丁烯二酸提取量的影响大小依次为：A>D>B>C，其中提取溶剂种类（A）对反丁烯二酸含量的影响最大，提取时间（B）和提取次数（D）的影响次之，影响最小的是料液体积比（C）。

方差分析表明，FA=2.76，小于临界值F0.05（2，2）=19.00，因素A对反丁烯二酸提取量的影响不显著。又因FB=0.70、FC=0.25、FD=1.03，均小于FA，故因素B、C、D对反丁烯二酸提取量的影响也不具有显著性。综合方差分析结果得PA

2.6 方法学考查

2.6.1 线性关系考查 分别精确移取对照品溶液，进样体积为20 μl，按上述色谱条件测定，记录色谱峰面积，以进样浓度X（μg/ml）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，考查对照品峰面积与对照品浓度（μg/ml）的线性关系。线性方程为Y=115 494.368 7X-96 957.422 9，相关系数r=0.999 9，线性范围为1.25～40.00 μg/ml。

2.6.2 阴性对照试验 分别精确移取色谱甲醇（溶解对照品的溶剂），进样体积为20 μl，按上述色谱条件测定，在8 min左右没有色谱峰出现。结果表明，色谱甲醇中没有反丁烯二酸，可以作为溶剂使用。

2.6.3 精密度试验 精密吸取反丁烯二酸对照品溶液（40 μg/ml）20 μl，连续进样3次，记录平均峰面积为4 527 353，RSD为0.89%（n=5），表明仪器的精密度良好。

2.6.4 稳定性试验 按“2.4.3”项下供试品溶液的制备方法，选择正交试验优化提取工艺，即用体积分数为90%的乙醇溶剂回流提取3次，每次2 h，料液体积比为8倍量，制备供试品溶液1份，每隔2 h测定1次，共测定5次，按上述色谱条件检测，记录峰面积。结果显示，反丁烯二酸的平均峰面积为1 261 030，RSD=1.53%（n=5），结果表明供试样品溶液在8 h内稳定。

2.6.5 重复性试验 取野木瓜药材各5 g，共6份，按“2.4.3”项下供试品溶液制备方法，选择正交试验优选的合理提取工艺，制备样品溶液6份，按“2.4.1”项下色谱条件测定，结果6份样品溶液反丁烯二酸含量的RSD为2.01%（n=6），表明反丁烯二酸测定方法具有良好的重复性。

2.6.6 加样回收率试验 采用加样回收法，精密称取已知质量分数的供试品，加入适量对照品溶液，以正交试验优选的合理提取工艺，按“2.4.3”项下供试品溶液制备方法，混匀，制备成供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件测定6次，反丁烯二酸的平均回收率为98.67%，RSD=1.92%，表明该提取方法具有良好的回收率。

2.6.7 样品含量测定 取反丁烯二酸对照品溶液，以等体积混合进样，测定峰面积和保留时间，反丁烯二酸在8 min左右出峰。分别精确称取野木瓜药材5 g，以正交试验优选的提取工艺，按“2.4.3”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件，进行反丁烯二酸的含量测定，结果显示，反丁烯二酸平均含量为38.56 μg/g，RSD为2.16%。

3 讨论

3.1 含量测定方法的选择

目前，野木瓜属植物的化学成分研究和生物活性研究主要集中于黄酮类、多糖以及皂苷类[8]，对有机酸的研究少有报道，本试验参照鹅掌柴属植物汉桃叶的有机酸含量测定方法，以反丁烯二酸为对照品检测野木瓜中有机酸含量，色谱条件为：C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸（5∶95）；检测波长：215 nm，流速：1 ml/min；柱温：30℃。利用HPLC方法学考察，结果表明，该方法能够实现野木瓜中反丁烯二酸的良好分离及准确测定，方法简便快捷，精密度高，重现性好。

3.2 检测波长的选择

取反丁烯二酸对照品适量，以流动相配制成对照品溶液，置于紫外分光光度计下，于200~400 nm波长范围内扫描，结果反丁烯二酸对照品溶液在215 nm处有最大吸收，试验结果显示，供试品在该测定条件下测定效果良好，故选择215 nm为反丁烯二酸的检测波长。

3.3 开发与应用

野木瓜是贵州、江西等地区的重要药材，野生资源极为丰富，仅江西赣南地区每年野生药材的收购量就在100吨以上[9]。野木瓜在药用、食用和观赏等方面具有开发应用价值，特别是药用价值方面，临床应用于治疗坐骨神经痛等各种疼痛，疗效显著，但对野木瓜属植物研究不足，至今，野木瓜属植物的研究资料表明，对本属植物资源的开发与应用除野木瓜和六叶野木瓜两种植物外，其余大部分种类的研究开发与利用工作尚未深入开展，在某种程度上阻碍了野木瓜属植物药用价值的开发。本研究运用正交试验得出野木瓜中反丁烯二酸提取条件的最佳工艺，为野木瓜的进一步深入研究提供了一定的科学依据。

[参考文献]

[1] 中国植物志编委会.中国植物志[M].29卷.北京:科学出版社,2001:23.

[2] 张贵君.现代中药材商品通鉴[M].北京:中国中医药出版社,2001:1151,1190.

[3] 史建敏,杨震玲,王秋梅,等.野木瓜用于术后镇痛的疗效[J].中国新药与临床杂志,2002,21(6):363-364.

[4] YE WB, LIU Q, YE Q, et al. The effects of injection stauntoniae on the condition of the saphenous nerve in rat [J]. Chin Tradit Herb Drugs,1995,26(1):20-21.

[5] 刘桂艳,张继,郑健,等.正交试验优选木通中木通酸和木通皂苷Stc的提取工艺[J].北京理工大学学报,2008,28(5):459-463.

[6] 徐剑,张永萍.汉桃叶药材含量测定方法的研究[J].贵阳中医学院学报,2008,30(2):73-77.

[7] 张国跃,罗定强,乔蓉霞,等.汉桃叶片质量标准研究[J].中成药,2008,30(6):附9-10.

[8] 陈国栋,杨磊,陈少丹,等.野木瓜属植物化学成分和生物活性研究概况[J].中药材,2008,31(2):309-315.

[9] 吴国卿,王文平,陈燕.野木瓜的资源状况与食品加工研究综述[J].贵州农业科学,2010,38(2):163-165.

（收稿日期：2011-08-18）