脾虚证大鼠肝组织端粒长度的变化及其与氧化应激关系的探讨

摘要：目的：探讨脾虚证大鼠肝组织的端粒长度变化及其与氧化应激反应的相关性，进一步揭示脾虚衰老的病理机制。方法：采用饮食不节和劳倦过度结合法建立脾气虚证模型，然后分别采用苦寒法和辛热法建立脾阳虚和脾阴虚证模型。分别用硫代已比妥酸(TBA)法、比色法和Southern blotting杂交法检测大鼠肝组织的丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Fx)活性和端粒(Tdomem)长度。结果：与正常对照组相比，脾阴虚模型组肝组织MDA含量升高明显，P

关键词：脾虚证；端粒长度；氧化应激；细胞衰老

中图分类号：R-33

文献标识码：A

文章编号：1673-7717(2007)12-2448-03

端粒是真核细胞内染色体末端的一种特殊结构，由重复的端粒DNA序列和相关端粒蛋白质组成。端粒DNA序列是非结构基因，不具备编码蛋白质的功能。由于细胞在有丝分裂时，会耗损染色体末端的部分DNA结构，而端粒在染色体的末端，每次染色体有丝分裂时损耗的是端粒，因此，端粒就像“保护帽”一样，保护着内部染色体的完整性。随着染色体的有丝分裂，端粒在逐步缩短，每次约丢失50～200个核苷酸，当端粒缩短至一定长度时，则细胞停止分裂，细胞老化而死亡。研究发现衰老时体内染色体末端的端粒长度缩短，因此端粒长度的变化可以作为细胞有丝分裂能力的生物钟，因而提出了衰老的端粒假说，衰老可能是由端粒的缩短导致的。有学者认为端粒长度可以作为评价衰老的生物学指标之一。

端粒特别是富含碱基G的重复串联结构，与基因组其他处相比更容易受到氧化应激的损伤。氧化应激使碱基G被氧化，特别强烈的氧化反应使端粒受到严重的损伤，引起端粒在非复制条件下断裂缩短。氧化应激是加速端粒缩短，从而加快细胞衰老和死亡的重要因素。抗氧化剂则可减少端粒的缩短，延缓细胞衰老进程。

1.材料与方法

1.1实验动物与分组

雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠45只(中国医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(辽)2003-O009)，平均体重(180±9.13)g。随机分成3组，即正常对照组(15只)、脾阳虚证模型组(15只)和脾阴虚证模型组(15只)，标准颗粒饲料。

1.2建立脾虚证模型

用复合因素塑造脾气虚、脾阳虚和脾阴虚证动物模型。从实验的第1天至第15天，采用饮食不节和劳倦过度结合法将模型组大鼠首先进行脾气虚造模。

第15天，运用模糊数学中模式识别方法开发的中医证候动物模型症状评价专家系统(2.0)对脾气虚模型进行评价后，符合标准者进入第二阶段造模。从实验的第16天至第25天，分别采用苦寒药和辛热药法将脾气虚证模型动物进行脾阳虚和脾阴虚造模。

第26天，运用模糊数学中模式识别方法开发的中医证候动物模型症状评价专家系统(2.0)对脾阳虚和脾阴虚证模型进行评价。

第27天，各组大鼠麻醉后立即取出肝组织，分别备测丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和端粒(Telomere)长度。

1.3肝组织MDA含量和GSH-Px活性测定

1.3.1主要仪器

美国BECHMAN产BIORAD-550型微孔板酶标仪、河北黄骅航天仪器厂产HH.W21.CR600型恒温水浴箱、XK96-A型快速混匀器、德国HERAEUS产BIOFUGE28RS型低温高速离心机。

1.3.2试剂及方法MDA测定盒和GSH-Px活性测定盒(南京建成生物工程研究所)。按试剂盒说明进行试剂配制，其它试剂均为国产分析纯。分别用硫代巴比妥酸(TBA)法和比色法测定，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.4肝组织端粒长度的测定

1.4.1主要仪器DY89-I型电动玻璃匀浆机(宁波新芝科器研究所)，HH.W21.CR600型恒温水浴箱(河北黄骅航天仪器厂)，DU-600型蛋白核酸分析仪(美国BECH-MAN)，BIOFUGE28RS型低温高速离心机(德国HERAE-US)，XK96-A型快速混匀器(姜堰市新康医疗器械有限公司)，EPS-300型电泳仪(上海天能)，DYCP-33A型电泳槽(北京六一仪器厂)，101-0A型电热鼓风干燥箱(天津泰斯特仪器有限公司)，1339-DNA型固液相分子杂交仪(北京市新技术应用研究所)，UV-2000紫外分析仪(上海天能)。

1.4.2试剂及方法 端粒长度检测试剂盒(Telo TAGGGTelomere Leneh Assay，Roche)，DNA提取试剂盒(大连宝生物)，杂交转移多用途琼脂糖(大连宝生物)，带正电荷尼龙膜(美国密理博)，杂交袋(Rocho)，其它为国产分析纯。首先提取DNA，用蛋白核酸分析仪检测DNA含量，用South-ern blotting杂交法检测端粒长度。

2.结果

2.1 脾阴虚证模型组大鼠肝组织MDA含量的变化

2.2脾阳虚证模型组大鼠肝组织GSH-Px活性的变化

2.3脾阳虚和脾阴虚模型组肝组织端粒长度的改变

3.讨论

关于端粒的丢失同衰老的关系理论是Olovaibov博士于1973年首次提出的，他认为端粒的丢失很可能是由于某种端粒相关基因发生的缺失。细胞衰老的端粒假说分析了人类染色体端粒由进化上高度的重复序列TrAGGG组成是维持染色体稳定的重要因素。在端粒酶合成处于抑制状态的细胞分裂时，随着细胞分裂次数的增加，端粒不断缩短。当端粒缩短到一定程度时，引发Hayflick极限，细胞不再分裂。

不同物证种之间端粒DNA脱氧核苷酸的组成及其长度不同。人类端粒DNA大约长2～15kb，大鼠为20～100kb，小鼠为100～150kb。同一物种不同组织细胞的端粒长度不同，同一种细胞不同生长时期也不同。随着连续的细胞分裂，端粒逐渐缩短，甚至完全丢失，最终细胞衰老死亡。老年人的端粒长度明显短于年轻人，说明端粒长度与细胞的寿命有关。随着年龄的增加，体细胞有丝分裂次数亦增加，端粒重复序列将逐渐丢失，从而导致染色体端粒长度缩短，而端粒的长短直接影响细胞内基因的表达，进而影响到细胞的增殖和寿命。因此，进一步探索衰老因素和长寿因素对端粒长度的影响，将对衰老与抗衰老具有十分重要的理论及实际意义。

衰老的自由基学说认为，衰老过程源于自由基对细胞及组织的损害。当自由基的产生与清除失去平衡时，过剩的自由基可引起氧化应激反应，蛋白质大分子交联，DNA损伤。细胞膜、线粒体膜脂质过氧化损伤，可减少受体的配位结合，抑制ATP腺苷酸环化酶的活性，而ATP合成的改变将影响和限制细胞总代谢。核膜的脂质过氧化物将直接损伤DNA，同时核与细胞质交换和RNA运输也将受到影响。目前认为，氧自由基与DNA的嘌呤、嘧啶碱基及脱氧核糖的相互作用可引起DNA共价键的断裂和链分离，端粒DNA也不能幸免。研究发现衰老动物细胞内DNA的断裂较多，且损伤后修复能力也较差，DNA损伤在端粒缩短中起着重要作用。

细胞衰老的主要机制是端粒缩短，端粒缩短又与氧化应激反应密切相关。由于每次分裂时细胞外部氧化应激与内部抗氧化能力的不同，因此细胞衰老的速率和端粒缩短决定于细胞的氧化应激程度与抗氧化能力的平衡。因此，降低机体过氧化反应、提高机体的抗氧化酶活性对于延缓端粒缩短、增加细胞寿命具有重要意义。

本课题组多年的研究证明，脾虚时自由基过氧化反应增强，机体清除自由基能力减弱，这与衰老时的变化类似。脾虚患者血浆过氧化物LPO含量显著高于无脾虚证者，而抗过氧化反应的超氧化物歧化酶SOD含量及其活性均明显低于无脾虚证者。脾气虚证、脾阳虚证和脾阴虚证血清及脑、肝、脾、肾等主要脏器的脂质过氧化物(LPO)含量升高、丙二醛(MDA)和共轭双烯(CD)的含量升高。在脾虚证与机体抗氧化酶关系的研究发现，上述脾虚三证血清抗氧化酶，包括谷胱甘肽过氧化物酶(SeGSFI-Px)、铜锌超氧化物歧化酶(CuZu-SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性下降。说明脾虚证机体过氧化反应增强，抗氧化系统功能降低。经补脾方药治疗后，上述变化明显改善。此次研究结果除再次证明脾虚证过氧化反应的关系外，还进一步证明了脾虚状态下，端粒长度的缩短与过氧化反应程度相一致。

脾虚证是导致衰老的主要原因，脾虚状态下机体内自由基异常增多，抗氧化能力明显下降，过氧化反应增强，导致过氧化损伤增强。而自由基可引起端粒DNA损伤，从而导致端粒的缩短。说明脾虚衰老状态下，自由基损伤增强，破坏染色体DNA的结构，影响端粒的长度及端粒酶的活性，端粒、氧化应激与脾虚衰老之间有一定的相关性。