黄芪总黄酮的提取工艺分析

【中图分类号】 R283 【文献标识码】A 【文章编号】1672－3783(2011)05－0286－02

【摘要】文章阐述了优选黄芪总黄酮的提取工艺。

【主题词】纤维素酶 黄芪 总黄酮

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus Technology或膜夹黄芪Astragalus membranaceus的干燥根,具有补气固表、利尿托毒、排脓、敛疮生肌等功效。黄芪中的主要有效成分为多糖、皂苷和黄酮类化合物,其中黄酮类化合物主要包括毛蕊异黄酮(calycosin ) 及其糖苷芒柄花素 (formononetin)和芒柄花苷(ononion) 等 。研究证实黄芪中的黄酮类成分具有多种药理活性,具有清除氧自由基、抑制脂质过氧化、增强免疫力、抗病毒以及促进细胞增殖的作用。

近年来，酶技术应用于中草药有效成分的分离提取取得了不少新的成果，尤其应用纤维素酶可破坏细胞壁的致密结构，加速药用有效成分的溶出，提高药用有效成分的提取率。

一 仪器与试剂

1 仪器：HH-6恒温水浴锅（江苏金坛市宏华仪器厂）；RE-52CS旋转蒸发器(巩义市英峪予华仪器厂)；予华牌循环水真空泵(河南省巩义市英峪予华仪器厂)；UV1101紫外/可见分光光度仪(上海天美科学仪器有限公司)；AY120电子分析天平（日本岛津公司）；KH-400KDB型高功率数控超声清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；摇摆式高速中药粉碎机(大德中药机械有限公司)。

2 试剂：乙醇（无水乙醇）；5%亚硝酸钠；10%硝酸铝；4%氢氧化钠；乙酸（冰醋酸）；无水乙酸钠；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号:050923）, 黄芪购自广州致信中药饮片有限公司，纤维素酶 (活性单位≥15 U／mg)由上海伯奥生物科技有限公司提供。

二 方法与结果

1 黄芪总黄酮成分提取：称取纤维素酶8 mg，用pH=4.5的HAc-NaAc缓冲液10 ml混合后与1g黄芪粉末（过50目筛）混合均匀，在30℃ 下处理1 h后加95％ 的乙醇20 ml，在70℃ 下浸提1 h过滤，用20 ml体积分数85％ 的乙醇洗涤残渣过滤，合并滤液，回收乙醇，残渣溶于质量分数为85%的乙醇，定容至25 ml，精密吸取1 ml于25 ml的容量瓶中，30%乙醇定容,得供试品溶液。

2 芦丁对照品溶液的制备：准确称取于芦丁对照品10 mg, 置于50 ml 容量瓶中, 加30%的乙醇30 ml, 超声使之溶解, 冷却至室温, 并稀释至刻度, 摇匀, 得浓度为200 μg/ml 的芦丁对照品溶液, 冷藏, 备用。

3 黄芪中总黄酮提取率的测定：取黄芪中总黄酮提取液用紫外分光光度计于500nm下测出吸光度A代入以下回归方程式及下列公式，计算出黄芪中总黄酮的提取率。提取率（%）=（C×V×10-6）W，式中V为定容体积（ml），W为黄芪药粉质量（g），C为黄芪提取液浓度（μg/ml）。

4 单因素实验及正交实验酶法提取的整个工艺分为酶解和浸提两部分，准确称取黄芪1g，加入缓冲溶液和一定比例的酶，黄芪经酶解后在相同的条件下浸提，过滤，按标准曲线方法测定吸光度。

1）考察酶解温度对总黄酮提取率的影响：称取纤维素酶8 mg，用pH=4.5的HAc-NaAc缓冲液10 ml混合后与1 g黄芪粉末（过50目筛）混合均匀，分别在30，35，40，45，50，55℃ 下处理1 h后加95％ 的乙醇20 ml，在70℃ 下浸提1 h过滤，用20 ml体积分数85％ 的乙醇洗涤残渣过滤，合并滤液，回收乙醇，残渣溶于质量分数为85%的乙醇，定容至25 ml，精密吸取1 ml于25 ml的容量瓶中，30%乙醇定容，按标准曲线操作测定总黄酮含量。由于一般纤维素酶的活性多在40～60℃较好，因此考察酶解温度为30，40，50，60，70℃对黄芪中总黄酮提取率的影响。

2）考察酶解时间对总黄酮提取率的影响：称取纤维素酶8 mg，用pH=4.5的HAc-NaAc缓冲液10 ml混合后与1 g黄芪粉末（过5目筛）混合均匀，在45 ℃下分别处理30，60，90，120，150 min后加95％ 的乙醇20 ml，在70℃下浸提1 h，过滤定容方法同上，随着酶解时间的延长，总黄酮的提取率也随着提高，当酶解2 h即可达到最佳效果，在2 h之前，延长酶解时间可明显提高总黄酮提取率，但在2.5 h实验时的总黄酮的提取率仅比2 h略高，说明酶解已经基本完成，没有再增加酶解时间的必要。

3） 考察酶用量对总黄酮提取率的影响：分别称取纤维素酶4，6，8，10，12 mg，用pH=4.5的HAc-NaAc缓冲液10 ml混合后与1g黄芪粉末（过5目筛）混合均匀，在45℃下处理1 h后加入95%的乙醇20 ml，在70℃ 下浸提1 h。过滤定容方法同上 在酶用量在8 mg之前，随着酶用量的增大，总黄酮的提取率逐步提高，酶用量到8 mg之后，总黄酮的提取率上升趋势不明显。 因此最佳的酶用量为8 mg。

4）正交实验上面讨论了各单因子的影响，但是在实际的操作中，各因素是相互交差影响的。经测定，在此最优工艺条件下，黄芪中总黄酮的提取率为0.402%。比较初步优化和正交优化的结果可以看出，两者的条件基本不同。原因可能在于4个主要因素相互影响，有相互作用。

三 讨论

实验结果表明，酶解时间的延长、酶量的适当加大、适当的温度和pH值有利于提高黄芪有效成分提取率。各因素对总黄酮的提取率的影响大小次序先后为：酶解温度＞酶量＞酶解时间。各因素的优化工艺参数为：A3B1C3,即酶解时间为120 min，酶解温度为30℃，酶量为12 mg，pH值为4.5。在此最优工艺条件下，黄芪中总黄酮的提取率为0.402%。如“2.4.3”项结果，在本实验参数的基础上，为了获得较高的提取率、节省酶用量，酶用量取8 mg。此工艺简单可行,是一条提取黄芪总黄酮类物质的有效途径。

纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称。黄芪细胞的细胞壁主要由纤维素构成，纤维素酶可以将其水解为葡萄糖，使其内容物更容易被提取出来。纤维素酶只是破坏黄芪细胞的细胞壁，其细胞内部物质并不含有纤维素类物质，因此纤维素酶对其内容物的成分没有任何影响。中草药种类繁多，有效成分结构复杂。为了提高中草药有效成分的提取率，可应用酶法提取中药有效成分。随着酶技术在中草药有效成分提取方面研究的不断深入，应用纤维素酶、果胶酶以及复合酶提高中草药药用有效成分的提取率，将成为充分利用中草药资源的有效途径，酶技术必将在中药现代化进程中发挥重要作用。

作者单位： 150008 哈尔滨珍宝制药有限公司