运动对骨头影响

神经营养因子（Neurotrophins，NTs）是一类能支持神经元存活，促进其生长、分化及功能维持的蛋白家族。肌源性NTs可以被运动神经轴突末梢摄取，逆行转运到神经元胞体，从而影响运动神经元的生存和分化，对NMJ的正常发育和功能维持起重要作用。与运动神经元有关的神经营养因子主要有神经营养素3（NT－3）、神经营养素4／5（NT－4／5）、脑源性神经营养因子（brain－derivedneurotrophicfactor，BDNF）［1］，其中，NT－3的受体为TrkC，NT－4和BD－NF的共同受体为TrkB。越来越多的证据显示，NTs及其受体Trks在出生后的一段时间内参与NMJ发育的过程，诱导NMJ由多神经支配向单一神经支配转化，实现功能成熟。NaganoM等检测出生后大鼠骨骼肌NT－3在转录水平和蛋白水平的表达，发现NT－3在腓肠肌的表达于出生后2周开始降低［11］，并且NT－3是胚胎发育期以及成熟以后骨骼肌表达最多的NTs［6］。已有研究发现，NT－4是维持突触后N型乙酰胆碱受体（nAchR）正常分布以及NMJ电生理反应和抗肌肉疲劳所必需的，也因此是维持运动神经肌肉功能的关键因子［2］，是成年期运动神经元生长和重塑的重要因子，并以活动依赖性模式运转。NT－4也因此与运动训练和电刺激造成的NMJ改变效应有关［4］。有证据表明，BDNF在出生后的腓肠肌持续地表达，提示其对促进NMJ功能发育及维持具有长期的作用，并可能在出生后扮演了将突触精细化塑形的角色［10］。关于运动训练是否会改变神经营养因子水平，目前有研究发现，运动可以使BDNF及其受体TrkB的表达水平升高，从而促进突触的功能性改变［15］，通过突触前去极化辅助NTs诱导NMJ突触功能增强，但目前在该领域还缺乏系统而深入的研究。本研究的目的即探讨在正常发育下，NTs在成长期的表达规律，以及运动对这些因子表达的影响，从而有助于了解早期运动能力获得的过程及神经营养因子在这个过程中的重要调控作用，丰富早期发展运动能力的基础理论。

1研究对象与方法

1．1研究对象出生18天的Sprague－Dawley（SD）雄性大鼠130只，随机分为对照组（ControlGroup，C组）、运动组（TrainingGroup，T组）和悬吊组（SuspensionGroup，H组）。对照组常规饲养；运动组进行跑台运动，运动负荷从8m／min、20min／d开始，运动强度和运动时间交替增加，至8周时达42m／min、60min／d，每天运动1次，每周运动6天；悬吊组采用尾部悬吊造成后肢悬空去负荷。对照组在3周龄时取材一次，各组在达4周龄、5周龄、6周龄、8周龄分别取材，按0．3ml／100g体重剂量腹腔注射10％水合三氯乙醛溶液麻醉，迅速分离出腓肠肌于预冷的生理盐水中漂洗，滤纸吸干，置液氮速冻待测。

1．2研究方法取－80℃冷藏的腓肠肌组织，应用酶联免疫吸附法（ELISA）测定NT－3及其受体TrkC、NT－4和BDNF及其受体TrkB蛋白水平。酶联免疫吸附法。主要仪器和试剂：大鼠组织用ElISA试剂盒（NT－3、NT－4、BDNF、TrkC、TrkB；UCL．co美国）；酶标仪（北京）。实验步骤：1．制备10％腓肠肌组织匀浆，－20℃过夜，经过二次冻融破膜，5000rpm离心5min，取上清液分装成150μl待测。

2．按说明书稀释标准品。3．取标准品及所有待测样品各100μl，加入到酶标板孔底部，轻轻混匀，覆膜，37℃孵育120min；弃去。每孔加检测溶液A100μl，37℃孵育60min；弃去，洗板2min×3次，每孔加检测溶液B100μl，37℃孵育60min；弃去，洗板2min×5次；每孔加底物溶液90μl，37℃避光孵育30min，见标准品的前4孔呈现明显的梯度蓝色即终止；每孔加入终止液50μl；立即在酶联仪上450nm波长读取各孔OD值。所得实验数据以均数±标准差（X±S）表示；用SPSS13．0统计软件进行MultivariateAnalysis检验周龄和运动因素对指标影响的显著性，One－wayANOVA比较均值，显著性水平取P＜0．05，非常显著性水平取P＜0．01。

2研究结果

2．1正常发育及运动干预下NT－3及其受体TrkC的蛋白水平结果显示（图1），正常发育下，NT－3蛋白水平在出生后3～4周出现第1个增长高峰（P＜0．05），之后下降（P＜0．01），5周龄以后出现第2个增长高峰（P＜0．01）；4周龄时悬吊组的蛋白水平显著低于对照组（P＜0．05），运动组则高于对照组（P＜0．05）。结果显示（图2），正常发育下，TrkC的蛋白水平与NT－3变化趋势相似，在出生后3～4周出现第1个增长高峰（P＜0．05），之后下降（P＜0．01）；在5～8周龄也有升高趋势，但未见显著性意义；4周龄时悬吊组的蛋白水平显著低于对照组（P＜0．05），运动组则非常显著高于对照组（P＜0．01）

2．2正常发育及运动干预下BDNF及其受体TrkB蛋白水平正常发育下，BDNF在出生4周龄后显著下降（P＜0．01），5～8周龄再次显著升高（P＜0．01）。运动干预下，4周龄时运动组显著高于对照组（P＜0．01），悬吊组则低于对照水平（P＜0．05），8周龄时也表现出类似的变化趋势（图3）。正常发育下，TrkB蛋白水平在3～4周龄和5周龄以后各有一次峰值（P＜0．01）；多因素方差分析显示运动因素对TrkB蛋白水平的影响无显著性意义（图4）。

2．3正常发育及运动干预下成长期大鼠腓肠肌NT－4蛋白水平结果显示（图5），5周龄时运动组NT－4显著高于对照组和悬吊组。多因素方差分析显示该指标不受周龄因素的影响。

3讨论

以往的研究表明，训练可以造成突触前、后膜成分的改变，一些由神经和肌肉释放的营养因子参与了这个过程［12］。与突触前膜神经末梢释放Agrin诱导NMJ发育和功能成熟的过程相对应，由骨骼肌细胞释放的NTs也在成长发育的特定阶段对运动神经元的维持和功能起重要调节作用。本研究通过酶联免疫吸附（ELISA）法测定了NT－3／TrkC、BDNF／TrkB和NT－4的蛋白水平。结果发现，以上几种NTs及其受体的蛋白水平在成长期大鼠腓肠肌具有一定的时间规律性变化，主要围绕出生后早期及青春期两个生长高峰起作用；运动干预对NT－4和出生后3～5周龄阶段的NT－3和BDNF蛋白水平都具有显著影响，特别是4周龄时对运动刺激非常敏感；Trk受体的变化趋势则大致与其主导因子相一致。

3．1成长期骨骼肌NT－3及其受体TrkC水平及运动干预的影响NT－3是已知最重要的运动神经元营养因子之一。本研究发现，骨骼肌NT－3水平在成长发育阶段受年龄因素的显著影响（P＜0．01），具有两次高峰水平，分别在时间上对应于出生后早期和青春期发育阶段。已知NT－3在大鼠出生后3周内可能有较高的转录水平，有研究发现，大鼠骨骼肌NT－3mRNA水平在出生后3周开始下降［8］，而NT－3蛋白水平在3～4周龄的峰值可能是由NT－3在出生后大量表达后翻译的滞后所引起的，因而出现随后的蛋白峰值。NT－3特征性的两次高峰水平可能与NMJ在出生后发育早期和青春期两个阶段的功能增强有关，并且第2高峰水平显著高于第1高峰，提示，相对于出生后早期，青春期阶段运动神经元的状态和功能可能发生更为显著的变化，而以往普遍认为NMJ在出生后早期发育成熟后就始终保持相对稳定。NT－3参与NMJ的发育可能是通过neuregulin等调节因子的作用来实现的［7］。已有的研究显示，NT－3能够促进腓肠肌神经支配再生［9］。NT－3还能和BDNF一起提高突触囊泡蛋白、突触体和突触素在运动神经元的蛋白水平，从而促进NMJ的结构成分合成，这些变化都与神经肌肉功能增强的过程相关。关于运动干预对NT－3及其受体TrkC水平的影响，本研究发现，运动能影响成长期大鼠NT－3的蛋白水平，特别是在4周龄阶段对运动刺激非常敏感，也有其他研究证实运动可以诱导肌纤维中NT－3表达增高［16］。神经肌肉活动在成长期发育过程中起到一定的作用，如果没有神经肌肉活动的刺激作为外因，NT－3在4周龄时的蛋白峰值可以被大幅度抑制，但高于日常活动水平的运动负荷并不能使NT－3水平过度增高，说明神经肌肉功能的发育仍遵循自身一定的自主性。运动干预引起TrkC蛋白水平的变化与NT－3基本一致，特别是在出生后早期阶段，说明TrkC受NT－3水平调控，进一步支持了运动对NT－3以及神经肌肉功能发育的促进作用；青春期阶段TrkC的变化幅度相对较小，NT－3是否在这一时期通过其他途径诱导NMJ的发育，有待进一步实验研究。

3．2成长期骨骼肌BDNF及其受体TrkB水平及运动干预的影响BDNF是另一种重要的运动神经营养因子，与NT－4共用受体TrkB，二者结合后可以促进运动神经元的存活，使突触传递效率增强，对NMJ发育和功能维持具有重要作用。在NMJ、BDNF连同周围施旺氏细胞（perisynapticSchwanncells，PSCs）对于成长期保持突触稳定都是十分重要的。BDNF和NT－4由肌纤维产生，其释放根据肌肉运动的需要由骨骼肌进行调控。本研究发现，BDNF受周龄（P＜0．01）和运动因素（P＜0．01）的双重影响，BDNF的蛋白水平也表现为2个增长高峰，分别出现在出生后3～4周和5周龄以后；运动干预对其具有显著作用，特别是在5周龄以前，运动能显著促进其蛋白水平的提高。过去的研究认为，骨骼肌BNDF仅在胚胎期有较高的表达，其主要功能是促进胚胎期运动神经元的结构分化和发育，而在出生后的表达很少。如Fanny等用Northern法检测大鼠出生后骨骼肌没有发现BDNF蛋白［3］，但Nagano等利用RT－PCR技术证实，大鼠出生后在腓肠肌BNDF有持续的表达，并且在出生后12周左右BNDF表达量高于出生后1周［11］，这与本研究的结果相同。因为出生后12周的高水平表达可能是延续了青春期发育的过程，是大鼠在成年期前为适应神经肌肉活动增强而出现的NMJ适应，其分子机制可能是BDNF通过促进ATP反应能力来增强PSCs反应性，从而促进信号转导过程［14］。方差分析显示，运动干预对TrkB蛋白水平没有显著性影响（P＞0．05），TrkB蛋白水平只受周龄因素的影响（P＜0．01）。图4中显示，正常发育情况下，TrkB蛋白水平具有和BNDF类似的两个高峰，提示，成长期TrkB蛋白水平不受神经肌肉活动外因的影响，而主要由其诱导因子按其自身发育进程诱导变化。

3．3成长期大鼠腓肠肌NT－4表达特征及运动干预的影响本研究发现，NT－4与NT－3和BDNF不同，方差分析显示，NT－4不具有类似的时间规律性，其表达水平不受周龄因素的影响（P＞0．05），而主要由神经肌肉活动强度调控，运动干预对NT－4蛋白水平具有显著性影响（P＜0．01）。NT－4不具有出生后3～4周龄的增长高峰，提示，NT－4主要与神经肌肉活动外因诱导下的NMJ功能完善有关。运动干预对NT－4表达的影响则十分显著，虽然仅在5周龄时运动组显著高于对照组，但运动组和悬吊组NT－4蛋白水平与对照组在整个成长期均具有显著差异的趋势，且运动组具有高于对照组的趋势，悬吊组具有低于对照组的趋势。以往研究也认为，NT－4维持着运动神经元末梢分支的完整，是成年期运动神经元生长和重塑的重要因子，并以神经肌肉活动依赖性模式运转，NT－4也因此与运动训练和电刺激造成的NMJ改变效应有关［2］，大鼠骨骼肌产生NT－4需要依赖于肌肉活动。本研究的这一结果与现有研究结论相符合，支持NT－4是维持突触后nAchR正常分布、维持正常NMJ电生理反应以及抗肌肉疲劳所必需的，也因此是运动依赖型突触连接以及维持神经肌肉功能的关键因子。也有研究显示，NT－4还参与胚胎期运动神经元的早期发育过程，促进NMJ获得早期自发性神经信号传递功能，神经肌肉联合培养实验在高表达NT－4的肌细胞上形成的NMJ其自发性突触活动水平和突触传递能力都高于普通肌细胞NMJ［5］。NT－4可以引起突触前转运分泌增强，同时使突触后膜低电导Ach通道平均开放时间延长。SakumaK等发现，NT－4在肌萎缩症小鼠小脑、脊髓和下肢肌肉的表达水平均明显低于正常［13］，从相反的角度为NT－4的作用提供了证据，即长期神经肌肉活动减弱时NTs的活动将由代偿转为退化，最后的结果是神经组织萎缩。尽管BDNF和NT－4均作用于TrkB受体并能引起许多相同的生物效应，并且都对运动因素具有一定的依赖性，但在不同的神经元细胞，在不同的神经元细胞的不同发育阶段，BDNF和NT－4也可以引起许多不同的生物效应，这可能是由于：1）BDNF和NT－4表达的时间和空间顺序性不同，BDNF参与整个成长期的NMJ发育和功能改善，但以出生后早期阶段作用更为显著，NT－4则主要参与促进成年期及之前过渡阶段的NMJ功能；2）BDNF和NT4与受体的亲和力不同，导致二者向神经元的逆向传送速度不同；3）BDNF和NT－4通过不同的连接部位与TrkB受体相连，有可能通过激活不同的信号途径引起细胞内不同的反应。

4研究结论

1．正常发育下，NT－3和BDNF及其受体蛋白水平表现在出生后早期和青春期的两次高峰，可能与NMJ以及神经肌肉功能在这两个阶段的发育有关。2．NT－4仅受运动干预的影响，可能主要与成长期及之后NMJ神经肌肉活动依赖发育有关。3．NT－3和BDNF受运动干预和周龄因素的双重影响，特别是在出生后早期阶段对运动刺激较为敏感，可能是运动在这一阶段能促进神经肌肉功能发育的内在机制之一。