基于液相蛋白芯片的甘草有效成分抑制巨噬细胞细胞因子谱表达的研究

[摘要]采用液相蛋白芯片技术检测了甘草酸和甘草总黄酮对脂多糖（LPS）诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型表达的23种细胞因子水平的影响。取对数生长期生长状态良好的RAW264.7细胞进行实验，分为正常对照组、模型组（1 mg・L-1 LPS）、甘草酸高、中、低剂量组（400，80，16 mg・L-1）、甘草总黄酮高、中、低剂量组（200，40，8 mg・L-1）和地塞米松组（5 mg・L-1）。细胞接种于24孔细胞板培养24 h后，依照实验分组分别向细胞板孔加入不同浓度的甘草酸、甘草总黄酮和地塞米松，孵育4 h后再加入LPS（1 mg・L-1）。20 h后收集各组细胞培养上清液，准备采用液相蛋白芯片技术检测上清液中23种细胞因子的水平。结果显示甘草酸能降低炎症模型产生的白介素类细胞因子IL-1β，IL-3，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70）和IL-13、嗜酸细胞活化趋化因子（Eotaxin）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）共10种细胞因子的表达水平；甘草总黄酮能降低IL-6和Eotaxin 共2种细胞因子的表达水平。提示有效地抑制多种炎症介质的释放、多靶点发挥抗炎效果，减轻系统性炎症反应，是甘草发挥抗炎作用的机制之一。

[关键词]甘草酸；甘草总黄酮；细胞因子；抗炎

甘草作为常用中药，活性高、作用广，具有显著的抗炎活性[1-3]，临床用于急慢性肝炎、支气管炎、银屑病和艾滋病的治疗[4-8]。其中甘草酸和甘草总黄酮类化合物是其抗炎、抗变应性炎症的主要活性成分，其抗炎作用与减少巨噬细胞炎症介质生成与释放关系密切 [9]。 常规研究技术如ELISA、免疫组化和Western blotting等多针对于个别蛋白质进行研究，对甘草及其有效成分的抗炎作用机制研究虽然很多，但呈现指标分散和局限的特点，缺少对其抗炎作用的系统认识。

液相蛋白芯片技术是在流式细胞技术、ELISA技术和传统芯片技术基础上研发的新型蛋白质研究平台，具有同步性好、特异性强、通量大和准确性高等特性，可高通量检测多种细胞信号分子的表达水平，非常适合于细胞因子表达的系统研究。因此，本研究利用脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞RAW264.7炎症细胞模型[10]，应用液相蛋白芯片技术[11]，通过测定甘草酸和甘草总黄酮对该模型细胞因子表达谱的影响，对甘草酸和甘草总黄酮的抗炎作用机制进行了较为系统全面的研究。

1 材料

甘草酸（纯度为98%，批号ZL201203010A）和甘草总黄酮（纯度为95%，批号ZL201204010A）购自南京泽朗医药科技有限公司、地塞米松磷酸钠注射液购自天津金耀集团湖北天药药业股份有限公司（国药准字H12020514）、脂多糖（Escherichia coli O111：B4，L2630）购自美国Sigma公司、小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心、Hyclone南美胎牛血清购自美国Thermo公司、DMEM高糖细胞培养基购自美国Gibco公司、Bio-Plex ProTM Mouse Cytokine 23-plex Assay购自美国Bio-Rad公司、Bio-Plex 200液相蛋白芯片分析系统购自美国Bio-Rad公司、小鼠IL-6 ELISA试剂盒购自北京旷博生物技术有限公司。

2 方法

2.1 药品配置 甘草酸、甘草总黄酮和脂多糖分别溶于高糖DMEM培养液中，配置成质量浓度均为1 g・L-1的溶液，溶液用0.2 μm注射器式过滤器过滤，分装保存于15 mL锥型离心管，以上操作均在超净台中进行。

2.2 细胞培养 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7用含10%胎牛血清、100 U・mL-1青霉素和100 mg・L-1链霉素的高糖DMEM培养液，在37 ℃， 5%CO2的培养箱中培养。每2～3 d换液，取对数生长期生长状态良好的RAW264.7细胞进行实验。

2.3 细胞分组及处理 将细胞分为正常对照组、模型组（1 mg・L-1 LPS）、甘草酸高中低剂量组（400，80，16 mg・L-1）、甘草总黄酮高中低剂量组（200，40，8 mg・L-1）和地塞米松组（5 mg・L-1）。取对数生长期生长状态良好的RAW264.7细胞进行实验，弃去原有培养液，加入适量高糖DMEM培养液，反复轻轻吹打制成每mL含1×105个细胞的单细胞悬液。24孔细胞板每孔接种1 mL细胞悬液，培养24 h。依照实验分组分别向细胞板孔加入不同浓度的甘草酸、甘草总黄酮和地塞米松，孵育4 h后再加入LPS（1 mg・L-1）。20 h后收集各组细胞培养上清液，冻存于-80 ℃超低温冰箱中备用。

2.4 Bio-Plex 200液相蛋白芯片分析系统检测细胞因子 待检测细胞上清液样品在室温下完全溶解，1万r・min-1高速冷冻离心10 min，取上清液用缓冲液1∶10稀释。依据试剂盒说明，每孔加入50 μL抗细胞因子抗体检测磁珠，洗涤2次，向相应孔板加入缓冲液、标准曲线样品溶液、待检测细胞上清液样品。室温下避光500 r・min-1摇床上孵育30 min，洗涤3次。依次分别加入检测抗体50 μL和Streptavidin-PE荧光色素50 μL，操作同上。每孔用125 μL缓冲液重悬微珠，放入Bio-Plex 200液相蛋白芯片分析系统读取各孔荧光强度， 并根据标准品的荧光强度计算出样品中白介素类因子IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13，IL-17，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、嗜酸细胞活化趋化因子（Eotaxin）、干扰素-γ（IFN-γ）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1） 、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、巨噬细胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）、巨噬细胞炎性蛋白-1β（MIP-1β）、受调节激活的正常T细胞排泌的因子（RANTES）、小鼠角化细胞源性细胞因子（KC）共23种细胞因子的浓度。

2.5 ELISA法测定IL-6浓度 待检测细胞上清液样品在室温下完全溶解，1万r・min-1高速冷冻离心10 min，取上清液用缓冲液1∶10稀释。按照ELISA试剂盒说明书进行测定，根据标准曲线计算各组培养上清液中IL-6的浓度。

2.6 统计学处理 实验数据用±s表示，组间比较采用单因素方差检测法进行统计学处理，P

3 结果

3.1 LPS对RAW264.7细胞表达细胞因子的影响 在正常RAW264.7细胞中，各种细胞因子均有低表达，经LPS刺激后RAW264.7细胞表达大量的细胞因子（P

3.2 甘草酸对LPS诱导RAW264.7细胞表达细胞因子的影响 甘草酸可以明显下调LPS诱导RAW264.7细胞表达多种细胞因子，其高剂量组的作用效果优于5 mg・L-1地塞米松组。高剂量组对IL-1β，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13，Eotaxin和TNF-α的表达水平有明显的下调作用（P

3.3 甘草总黄酮对LPS诱导RAW264.7细胞表达细胞因子的影响 结果见表1。甘草总黄酮的作用效果接近于5 mg ・L-1地塞米松，对LPS诱导RAW264.7细胞表达的2种细胞因子水平有明显的下调作用：高剂量组能极明显下调IL-6的表达水平 （P

3.4 ELISA法检测药物对LPS诱导RAW264.7细胞表达IL-6的影响 ELISA法测定IL-6的实验结果与Bio-plex液相蛋白芯片的相一致，表明液相蛋白芯片方法的敏感性与商品化ELISA试剂盒相当。甘草酸中、高剂量组和甘草总黄酮高剂量组能极明显下调IL-6的表达水平 （P

4 讨论

液相蛋白芯片技术同步性好、通量大、准确性高等特性能很好的突破传统中药研究中单个散在指标 的局限性，节约珍贵样本，提高中药研究结果的准确性和可靠性，全面把握中药药效作用的多个关键环节，系统地阐明中药多通道、多靶点的作用机制。毛予龙等[12]报道了甘草酸苷能够有效抑制LPS诱导小鼠RAW264.7细胞表达IL-6；王大南等[13]报道了甘草酸苷抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α；杨晓露等[2]报道了甘草黄酮类单体异甘草素能抑制RAW264.7细胞表达IL-1β和IL-6。与以往研究相比，本研究首次应用液相蛋白芯片技术检测了甘草酸和甘草总黄酮对LPS诱导小鼠RAW264.7细胞表达的IL-6，IL-10和TNF-α等23种细胞因子的影响，首次发现了甘草酸能够抑制LPS诱导小鼠RAW264.7细胞表达IL-1β，IL-3，IL-5，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13和Eotaxin，甘草总黄酮够抑制Eotaxin的表达。

甘草酸能降低LPS诱导巨噬细胞产生的IL-1β，IL-3，IL-5，IL-6，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13，Eotaxin和TNF-α共10种细胞因子的表达水平，从而抑制了T细胞的活化、B细胞的成熟、嗜酸性粒细胞和自然杀伤细胞的增殖；降低了抗体、前细胞因子、成纤维细胞产生的淋巴因子、集落刺激因子和急性期反应蛋白的表达水平；增强了单核巨噬细胞表面MHCⅡ类分子的表达；减轻了机体局部或整体的炎症反应。甘草总黄酮能降低IL-6和Eotaxin的表达水平，从而减少了抗体的表达水平，抑制了嗜酸性粒细胞的增殖和趋化，起到了抗炎作用。甘草酸和甘草总黄酮的抗炎作用可能是通过抑制LPS与巨噬细胞表面TLR4受体结合，降低TLR4受体的活性，阻遏磷酸化的TLR4与MyD88蛋白的结合，抑制NIK蛋白激酶的自身磷酸化激活，阻遏IκB-α，IκB-β激酶的泛素化降解，稳定NF-κB的非活性结构，抑制与炎症反应相关基因的转录来实现的。

本研究显示尽管甘草总黄酮抑制细胞因子的范围不及甘草酸，但两者都能通过有效抑制多种细胞因子的释放，发挥多靶点抗炎效果，减轻系统性炎症反应，起到显著的抗炎作用；蛋白芯片研究技术可对甘草不同有效成分抑制细胞因子的释放水平、抑制范围和作用特点进行同步比较研究，能系统准确地把握中药的抗炎机制作用特点，是适用于中药及其成分药效及分子机制研究的有效蛋白质组学技术。

[参考文献]

[1]高雪岩，王文全，魏胜利，等.甘草及其活性成分的药理活性研究进展[J].中国中药杂志，2009，34（21）：2695.

[2]杨晓露，刘朵，章丹丹，等.甘草总黄酮及其成分体外抗炎活性及其机制研究[J].中国中药杂志，2013，38（1）：99.

[3]Shin Y W，Bae E A，Lee B，et al.In vitro and in vivo antiallergic effects of Glycyrrhiza glabra and its components[J].Planta Med，2007，73（3）：257.

[4]韩俊岭，郭昱.复方甘草酸苷治疗急性胰腺炎肝损害的疗效观察[J].中国误诊学杂志，2008，8（3）：556.

[5]张明发，沈雅琴.甘草及其提取物对呼吸系统的药理作用[J].现代药物与临床， 2010， 25（4）： 262.

[6]王英杰，范慧英，路云环.复方甘草酸苷对银屑病患者T细胞免疫功能的影响[J].中国麻风皮肤病杂志，2007，23（6）：533.

[7] Pliasunova O A，Il′ina T V，Kiseleva Iaiu，et al.The anti-HIV activity of glycyrrhizic acid penta-O-nicotinate[J].Vestn Ross Akad Med Nauk，2004（11）：42.

[8]韩瑶聃，王彬，王政雨，等. 甘草酸药理作用的研究进展[J]. 中国新药杂志，2012，21（21）：2499.

[9]Kim J K，Oh S M，Kuon H S，et al.Anti-inflammatory effect of roasted licorice extracts on lipopolysaccharide induced inflammatory responses in murine macrophages[J].Biochem Biophys Res Commun， 2006， 345（3）：1215.

[10] Xia Z，Triffitt J T.A review on macrophage responses to biomaterials[J].Biomed Mater，2006，1：R1.

[11]Xi S，Zhi Y L，Hui P，et al .Effects of a recombinant schistosomal-derived anti-inflammatory molecular （rSj16） on the lipopolysaccharide （LPS）-induced activated RAW264.7[J].J Clin Biochem Nutr，2010，46：119.

[12]毛予龙， 徐歆， 李卫芬， 等.甘草酸苷对体外小鼠单核巨噬细胞细胞因子分泌的影响 [J].中国预防兽医学报， 2012，34（10）：823.

[13]王大南， 于淼， 吕昌龙， 等.甘草酸苷调节小鼠腹腔巨噬细胞活性的研究 [J].中国免疫学杂志，2009，25（9）： 805.

Effects of glycyrrhizin acid and licorice flavonoids on LPS-induced

cytokines expression in macrophage

LIU Zhao， ZHONG Ju-ying， GAO Er-ning， YANG Hong*

（Experimental Research Center， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Glycyrrhizin acid and licorice flavonoids are the component of Glycyrrhiza uralensis Fisch root that has been used for various medicinal purposes in traditional oriental medicine for thousands of years. Macrophages as a principal component of immune system play an important role in the initiation， modulation and final activation of immune response against pathogens.In the present study， glycyrrhizin acid and licorice flavonoids was investigated the anti-inflammatory effect on lipopolysaccharide （LPS）-induced macrophage cell line of RAW264.7. Well-grown RAW264.7 cells were collected and randomly divided into the blank control group， the LPS（1 mg・L-1）group， the dexamethasone（5 mg・L-1）with LPS group，the glycyrrhizin acid（400，80，16 mg・L-1）with LPS group and the licorice flavonoids（200，40，8 mg・L-1）with LPS group. RAW264.7 cells were cultured in 24-well plates， pre-incubated for 4 h with different concentrations of dexamethasone， glycyrrhizin acid ，or licorice flavonoids .Then cells were stimulated for 20 h with LPS. The supernatant of culture medium was collected from each well and determinated the concentrations of cytokines by means of Bio-Plex mouse cytokines assay. Compared with the control group， the LPS group could significantly induced relatively high levels of granulocyte colony stimulating factor （G-CSF），granulocyte-macrophage colony stimulating factor（GM-CSF），macrophage inflammatory protein-1 alpha （MIP-1α），macrophage inflammatory protein-1 beta（ MIP-1β），regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor（RANTES），tumor necrosis factor alpha（TNF-α），monocyte chemotactic protein 1（MCP-1），chemokine （C-X-C motif） ligand 1（KC），eotaxin，interleukin（IL）-1α，IL-1β，IL-3，IL-4， IL-5，IL-6，IL-10，IL-12（p40），IL-12（p70），IL-13， and IL-17 secretion（P

[Key words] glycyrrhizin acid； licorice flavonoids； cytokine； anti-inflammatory

doi：10.4268/cjcmm20141935