妥舒沙星人体血药浓度测定及药代动力学研究

【摘要】 目的 建立反相高效液相色谱荧光检测法测定人血浆中妥舒沙星浓度的方法。方法以加替沙星为内标，血浆经酸化采用20%高氯酸提取，色谱柱为XDB C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为乙腈甲醇20 mmol•L-1磷酸二氢钾（15∶15∶70），荧光检测(λex=342 nm，λem=420 nm)。结果 妥舒沙星血浆浓度在10.80~1296 ng•ml-1内具有良好线性关系，平均相对回收率大于95%，萃取回收率大于60%，日内、日间相对标准差（RSD）均小于4.3%。结论该方法灵敏、准确，可用于妥舒沙星的药动学研究。

【关键词】 高效液相色谱荧光法；妥舒沙星；血浆

文章编号：1003-1383(2010)06-0675-04 中图分类号：R 927.2 文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1003-1383.2010.06.010

Determination of tosufloxacin in human plasma by reversedphase highperformance

liquid chromatographic fluorometry

HUANGShiqian

（Medical School Affiliated Hospital of Guangxi Guidong, Wuzhou 543100）

【Abstract】 ObjectiveA sensitive liquid chromatographic fluorometry was developed for the determination of the active metabolite of tosufloxacin.

Methods Gatifloxacin was used as the internal standard.After adding 20% perchloric acids to plasma samples, precipitating and centrifugating,plasma samples were separated on a XDB C18 column (150×4.6mm,5μm), with the mobile phase consisted of acetonitrilemethanol20 mmol•L-1 KH2PO4 (15∶15∶70,v∶v∶v) .The fluorescence detection wave length was λex=342 nm，λem=420 nm.

Results The calibration curves was linear over the concentration ranged of 10.80 to 1296ng•ml-1(r=0.9987),The average relative recovery was 95.62%~107.7%,RSD was 1.4%~2.5%. The extraction recovery was 2.3%~6.4%.Intraand interday precision ranged from 1.4 to 2.5 and 2.8 to 4.3%respectively.

Conclusion The method was sensitive，rapid and accurate and could be used in the monitoring of therapeutic drugs and human pharmocokinetic study of tosufloxacin.

【Key words】HPLC;tosufloxacin;plasma

妥舒沙星属于第4代喹诺酮类抗生素，具有抗菌谱广、抗菌活性强的特点，尤其对需氧革兰阳性球菌和厌氧菌的作用较强。目前在临床上妥舒沙星主要用于治疗呼吸道、胆道、皮肤软组织、耳鼻喉和口腔等感染［1］但有关妥舒沙星血药浓度测定的报道较少［2，3］，且普遍存在测定灵敏度低、最低定量下限较高的弊端。笔者建立高效液相色谱荧光法测定健康人血浆中妥舒沙星的药物浓度分析方法，发现该方法操作简单、快速、灵敏度高，结果准确，可用于妥舒沙星人体血药浓度测定及药动学研究。

材料与方法

1.药品与仪器①仪器：Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent)；AG285分析天平（瑞士Mettler Toledo公司)；MS1 Minishaker 涡旋振荡仪(广州科仪实验室技术有限公司)；Biofuge stratos 高速冷冻离心机(德国heraeus)。②药品与试剂:妥舒沙星对照品(赤峰万泽制药有限责任公司,批号:20070504)；加替沙星(内标,中国药品生物制品检定所)。试剂：甲醇、乙睛为色谱纯，水为二次蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2.方法

（1）色谱条件 色谱柱为XDB C18 (4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相为乙腈:甲醇:20 mmol•L-1KH2PO4=15∶15∶70；流速为1.0 ml•min-1；柱温30℃；检测波长为：λex=342 nm，λem=420 nm。

（2）对照品与内标储备液的配制 精密称取妥舒沙星标准品10.8 mg于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，再取1 ml该溶液于100ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度，得浓度为10.8 g•ml-1的储备液，于4℃冰箱保存。

精密称取加替沙星标准品16.0 mg于100 ml容量瓶中，用蒸馏水溶解并稀释至刻度，得浓度为160.0g•ml-1的内标物储备液，于4℃冰箱保存［4］。

（3）血浆样品前处理 取0.2 ml肝素抗凝血浆样品置1.5 ml离心管中，加入32g•ml-1内标加替沙星10L，1 mol•L-1盐酸20 L，甲醇100L，混匀，加入20L 20%高氯酸，12000 r•min-1高速离心15 min，取出上清液，进样40L。

结果

1.方法的专属性 图1~3中分别为空白血样、空白血样中加入对照品、服药后血样色谱图。妥舒沙星保留时间约为7.5 min，内标加替沙星保留时间约为4 min，血浆内源性物质及其它杂质不干扰样品和内标的测定。

2.线性范围及最低定量下限 分别精密吸取妥舒沙星标准储备液适量，用空白血浆稀释成不同浓度（10.80 ng•ml-1、32.40 ng•ml-1、108.0 ng•ml-1、324.0 ng•ml-1、648.0 ng•ml-1、1296 ng•ml-1）的标准液，按样品处理方法处理，妥舒沙星与内标峰面积之比（Y）与妥舒沙星浓度（X）进行加权线性回归，得直线回归方程Y=0.001X－0.0219，线性系数为r=0.9997（见图4），妥舒沙星浓度在10.80 ng•ml-1~129 ng•ml-1范围内线性关系良好，该方法血浆中妥舒沙星最低定量下限为10.80 ng•ml-1。

3.精密度及回收率 配制浓度为低、中、高（32.40 ng•ml-1、324.0 ng•ml-1、1296 ng•ml-1）的妥舒沙星标准血浆各5份，按样品处理方法平行操作，得日内相对标准差（RSD）分别为 2.5%、2.4%和1.4%，平均相对回收率分别为107.7%、95.6%和107.3%（表1）；连续测定3天，得日间相对标准差（RSD）分别为 4.3%、2.8%和2.8%（表2）。

4.萃取回收率 配制浓度为低、中、高（ 32.40 ng•ml-1、324.0 ng•ml-1和1296 ng•ml-1） 的妥舒沙星标准血浆各5份，按样品处理方法处理进样，另用流动相配制相应浓度妥舒沙星溶液，不经处理直接进等量样品，以此为标准，两组峰面积之比值得妥舒沙星的萃取回收率分别为61.7%、90.2%和86.2%，内标加替沙星经同法处理得相应萃取回收率为93.3%。见表3。

5.稳定性考察

（1）血样的室温稳定性 配制低、中、高（32.4 ng•ml-1、324 ng•ml-1和1296 ng•ml-1）的妥舒沙星标准血浆样品，室温放置，分别在0 h、4 h、8 h、12 h按样品处理方法处理进样，记录对照品及内标的峰面积。结果浓度的RSD为4.0％、8.5%、1.6%（表4），结果表明低、中、高（32.40 ng•ml-1、324.0 ng•ml-1和1296 ng•ml-1）妥舒沙星血样在室温下12 h内稳定。

（2）血样的冻融稳定性 配制低、中、高（32.40 ng•ml-1、324.0 ng•ml-1和1296 ng•ml-1）的妥舒沙星标准样品，置-2℃ 冰箱冷冻，取出样品室温融解，然后再冷冻，反复3次，每次按样品处理方法处理，记录对照品及内标的峰面积。结果浓度的RSD为3.3％、7.0%、0.95%（见表5），结果表明低、中、高（32.4 ng•ml-1、324 ng•ml-1和1296 ng•ml-1）妥舒沙星历经3次冻融后稳定。

6.人体药代动力学实验选择20名男性健康志愿受试者，年龄19～26岁，体重57～78 kg，身高166～183 cm,常规体检及生化检验结果证明肝肾功能正常，心电图正常，生活习惯良好，无异常既往病史。试验经伦理委员会批准，受试者试验前均签署知情同意书。受试者随机交叉服用试验制剂（甲苯磺酸妥舒沙星分散片，0.15 g/片，批号：20070708）和参比制剂（甲苯磺酸妥舒沙星片，0.15 g/片，批号：20070504）。受试者进清淡晚餐后禁食过夜（至少10小时），于晨起空腹服药［单次服用2片受试制剂（T）或2片参比制剂（R），用量0.3 g］第一周期试验于给药24 h后结束，经过7天洗脱时间后开始下一周期试验，方法同第一周期试验。服药前（0 h）及服药后0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h分别从肘静脉取血4 ml，肝素抗凝，分离血浆至-20 ℃保存。两制剂主要药动学参数见表6；血药浓度时间曲线见图4。

讨论

在血浆样品处理过程中，笔者比较了20%高氯酸、三氯乙酸和乙酸乙酯三种提取溶剂，发现采用20%高氯酸提取的血样色谱行为干净，无内源性杂质干扰，且血样中妥舒沙星的提取比例要高于三氯乙酸、乙酸乙酯。而比较提取后用40℃氮气吹干，流动相溶解进样与提取离心后直接进样的方法发现，后者提取效率更高。妥舒沙星为弱酸性化合物，在酸性环境中其主要以分子形式存在，有助于提高有机溶剂萃取率，实验中笔者比较了磷酸、1 mol•L-1盐酸两种酸化方式，发现以1 mol•L-1盐酸酸化效果最好，样品杂质少、提取率高。

在内标的选择上，实验前考察了培氟沙星、帕珠沙星、加替沙星等化合物［5,6］。在本文色谱条件下，培氟沙星和帕珠沙星的保留时间与妥舒沙星相差太远；且帕珠沙星的色谱行为较差，最终发现加替沙星色谱行为好，保留时间与妥舒沙星比较接近，且在样品提取条件下，萃取回收率高，故选择加替沙星为内标。

有文献［2］报道流动相选用甲醇乙腈0.05%H3PO4（pH=4.0），但酸性越低，妥舒沙星色谱峰形差、易脱尾，经实验摸索采用20 mmol•L-1KH2PO4作为水相，确定流动相为甲醇乙腈20 mmol•L-1KH2PO4（15∶15∶70）（醋酸调pH至6.0），妥舒沙星峰和内标峰分离完全，峰型好，不受内源性杂质峰干扰，妥舒沙星和加替沙星色谱峰也比较稳定，故选择此混合溶液为流动相。

高效液相色谱荧光法灵敏度高，干扰因素多［7］。人血清中某些氨基酸及其代谢产物本身具有荧光，可能会干扰妥舒沙星的测定，因此采用适宜的提取方法显得尤为重要。本实验采用经酸化采用20%高氯酸提〗取的方法简便易行，回收率高，收干扰因素少，符合实验要求。

本实验采用高效液相色谱荧光法测定血浆中妥舒沙星浓度的方法，具有较高的灵敏度和选择性，是体内药物分析常用的分析方法之一，能够满足本试验低浓度药物测定以及药物动力学研究的要求。

参考文献

［1］刘明亮.喹诺酮类抗菌药的概况与展望［J］.国外医药抗生素分册，2001,22（1）:1-4.

［2］李 勇，袁 洪，谭鸿毅，等.高效液相色谱法测定人体内血浆中的妥舒沙星［J］.南华大学学报，2007，35（1）:104-106.

［3］陈 悦，骆晓斌.高效液相色谱法测定甲苯磺酸妥舒沙星的含量［J］.西北药学杂志，1999，14（2）: 51-52.

［4］潘龙华，李小刚.高效液相色谱法测定加替沙星的血药浓度［J］.时珍国医国药，2007, 5(2):408.

［5］Appelbaum PC,Hunter PA.The fluoroquinolone antibacterial:past,present,andperspectives［J］. Int J Antimicrob Agents，2000，16(1):5-15.

［6］S Diane Goodwin,et al.Pharmacokinetics and safety of levofloxacin in patients with human immunodeficiency virus infection［J］.Antimicrob Agents Chemother,1994,38(4):799-804.

［7］Nobuki Aoki,Usuda Y,koda Y,et al.Clinical pharmacology and efficacy of levofloxacin in elderly patients［J］.Jap J Antibiot,1992,45(5):530-538.

(收稿日期：2010-08-23 修回日期：2010-11-11)

(编辑：梁明佩 英文审校：钟京梓)

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