时间：2022-09-09 01:00:34
摘 要 建立了分子印迹固相萃取结合气相色谱-质谱测定猪尿中β-受体激动剂氯丙那林、马步特罗、克伦特罗、莱克多巴胺的方法。应用分子印迹柱富集并净化猪尿液中4种β-受体激动剂，比较了分子印迹固相萃取与常规固相萃取的净化效果。通过BSTFA-1% TMS硅烷化衍生，氘代克伦特罗和氘代莱克多巴胺为校正内标，气相色谱-质谱测定。在优化条件下，4种β-受体激动剂在5～100
SymbolmA@ g/L范围内具有良好的线性关系，线性相关系数大于0.99；方法检出限低于0.5
SymbolmA@ g/L； 回收率为75.1%～97.5%； 相对标准偏差低于10%。利用本方法对实际样品中克伦特罗和莱克多巴胺进行测定， 结果表明， 本方法的精密度和准确度较好；本方法无需液液萃取，操作简单，准确性和稳定性好。
关键词 分子印迹固相萃取； β-受体激动剂； 气相色谱-质谱
2011-06-30收稿；2011-08-26接受
本文系“十二五”国家科技支撑计划课题（No.2011BAD26B04）资助
* E-mail: zhihuaye@mail.省略
1 引 言
克伦特罗通常用于治疗支气管炎[1]。因其具有水解脂肪、合成代谢和对非条纹肌肉组织的松弛作用，被非法用作动物养殖的促生长剂，提高动物的瘦肉产率。莱克多巴胺、氯丙那林和马步特罗为合成类β-受体激动剂，与克伦特罗具有类似作用。不法分子在利益驱动下，将克伦特罗类似作用的β-受体激动剂类药物用于动物养殖，如2011年河南“瘦肉精”事件，给常规检测和日常监管带来极大挑战。为了确保动物源性食品安全，农业部176号和1519号公告中明确规定；禁止将克伦特罗、莱克多巴胺、氯丙那林和马步特罗用于动物养殖。
β-受体激动剂类药物的测定主要通过液液萃取[2]、固相萃取[3,4]和免疫亲和萃取[5]等前处理技术进行净化。液液萃取需要大量溶剂，且耗时；常规固相萃取分析速度快，所需溶剂量少，但选择性差，难以消除复杂样品基质影响；免疫亲和固相萃取选择性好，但成本较高，且应用条件苛刻。分子印迹固相萃取通过空间形状、孔穴大小以及识别位点对目标分析物进行识别，能够实现选择性萃取和富集目标分析物，同时除去干扰物以减小基体抑制作用，提高分析方法的性能[6,7]。应用分子印迹固相萃取结合高效液相色谱串联质谱研究建立动物组织中β-受体激动剂的测定方法已有报道[8～10]，但HPLC-MS/MS成本高，不易普及。王培龙等[11]应用分子印迹固相萃取结合气相色谱-质谱研究建立了动物尿液中盐酸克伦特罗的测定方法，方法具有很高的灵敏度、稳定性和可靠性。
本研究应用MIP固相萃取柱净化和富集猪尿液中的克伦特罗、莱克多巴胺、氯丙那林和马步特罗等β-受体激动剂，采用BSTFA-TMS衍生化，GC-MS对4种β-受体激动剂进行定性和定量分析。本方法能有效消除尿液的基体干扰，具有较低的检出限和较高的精密度，能够对猪尿液中克伦特罗、莱克多巴胺、氯丙那林和马步特罗进行准确的定性和定量分析。本方法简单、快速，结果令人满意。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
Trace DSQⅡ气相色谱-质谱仪（美国Thermo Scientific公司）；DB-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25
SymbolmA@ m， 美国J&W公司）；载气为氦气（纯度99.999%）; DHG9070A型恒温烘箱（上海精宏实验室仪器设备公司）；移液枪（Eppendorf, Germany）分子印迹固相萃取小柱（β-Agonists, 10 mL, 25 mg, Lund, Sweden）； 甲醇、乙酸和甲苯（色谱纯，Merck公司），其它试剂为分析纯；N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺（含1%三甲基氯硅烷）（BSTFA-1% TMCS，SUPELCO公司）；盐酸克伦特罗（Clenbuterol，Clen）、莱克多巴胺（Ractopamine，Rac）、氯丙那林（Clorprenaline，Clp）和马步特罗（Mabuterol，Mabu）、克伦特罗D9（Clen-D9）和莱克多巴胺D5（Rac-D5）购自Sigma公司；阴性猪尿液样品和阳性猪尿液样品由国家饲料质量监督检验中心（北京）提供。
2.2 标准溶液的配制
分别称取盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、氯丙那林和马步特罗等标准品（纯度＞99.5%）各20.00 mg，溶于甲醇并定容至100 mL，该贮备液浓度为200 mg/L。采用甲醇对β-受体激动剂进行适当稀释，获得标准液。
2.3 样品前处理
分子印迹固相萃取步骤如下： 猪尿液用前以3000 r/min离心10 min。取4 mL猪尿液，加入同位素内标，用25 mmol/L（pH 6.7）的乙酸铵缓冲液稀释尿样（1∶1，V/V）。MIP固相萃取柱依次用1 mL的甲醇、1 mL水和1 mL 25 mmol/L乙酸铵缓冲液活化。取稀释后猪尿样过柱。用1 mL水淋洗，真空泵抽干2 min。依次用1 mL含1％乙酸的乙腈溶液和1 mL 0.5 mol/L乙酸铵缓冲液（pH 5）进行淋洗，真空抽干2 min。用1 mL 10％乙酸/甲醇溶液洗脱2次，抽干2 min。控制整个过程中的流速为0.5 mL/min，洗脱流速为0.2 mL/min。取净化后的样品和4种β-受体激动剂标准溶液用氮气吹干，加入100
SymbolmA@ L BSTFA＋1% TMS衍生化试剂，振荡，密封，置于75 ℃的烘箱中衍生30 min，冷却，用氮气吹干。加入200
SymbolmA@ L甲苯溶解，振荡，上机分析。
混合阳离子固相萃取柱（MCX）净化步骤如下： 猪尿液用前以3000 r/min离心10 min。取4 mL离心后的猪尿样，加入同位素内标，用HClO4调至pH 5。MCX固相萃取柱用3 mL甲醇和3 mL水活化。上样后，用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，用3 mL含5%氨水的甲醇溶液进行洗脱，吹干。衍生化后待测。
2.4 色谱和质谱条件
仪器进样口温度为260 ℃；进样量为1.0
SymbolmA@ L, 不分流模式；柱始温为70 ℃保持1 min，以25 ℃/min程序升温至200 ℃，保持6 min，再以25 ℃/min程序升温至280 ℃，保持2 min。EI源电子轰击能70 eV，检测器温度200 ℃，接口温度250 ℃，质量扫描范围为70～400 AMU，溶剂延迟8 min。
3 结果与讨论
3.1 仪器条件优化
为提高4种β-受体激动剂检测的选择性和灵敏度，采用选择离子检测模式（SIM）。利用4碎片离子的相对丰度结合保留时间可以对实际样品中4种β-受体激动剂的衍生物谱峰进行确证。4种β-受体激动剂和2种氘代同位素内标的监测参数见表1。以Clen-D9为氯丙那林、马步特罗和克伦特罗的内标， Rac-D5为莱克多巴胺的内标，对样品中4种β-受体激动剂进行定量分析。
3.2 净化效果比较
尿液组成复杂，含有大量尿酸、尿嘧啶和蛋白等杂质。同时动物个体差异也导致尿液基体组成变化较大。因此，尿液样品基质干扰是影响β-受体激动剂测定因素之一，进而影响分析检测的灵敏度和准确性。为了评价MIP与MCX固相萃取的净化效果，4种β-受体激动剂在动物尿液中的添加浓度为10
SymbolmA@ g/L，通过MIP和MCX固相萃取净化后衍生，应用GC-MS测定，得到4种β-受体激动剂的信噪比（表2）。由表2可知，MIP固相萃取能够有效的消除尿液样品基质对4种β-受体激动剂的影响，提高检测的灵敏度和稳定性（图1）。 图1 β-受体激动剂及同位素内标色谱图（50
SymbolmA@ g/L）
Fig．1 Chromatogram of β-agonists and isotope inner-standards（50
SymbolmA@ g/L）
3.3 方法的分析性能
衍生不同浓度梯度的β-受体激动剂标准溶液和内标溶液, 每个衍生化样品平行进样3次，获得氯丙那林、马步特罗、克伦特罗和莱克多巴胺的线性范围为5～100
SymbolmA@ g/L，线性相关系数大于0.99。取尿液4 mL，用甲苯定容至200
SymbolmA@ L。在仪器状态稳定的前提下，通过计算空白样品信号的平均值（B）和标准偏差（SD），根据检出限LOD＝B＋3SD和定量限LOQ＝
表3 猪尿液中β-受体激动剂分析方法参数
Table 3 Analytical parameters of developed method
化合物Compound线性范围Linear range（
SymbolmA@ g/L）线性相关系数Correlation
coefficient检出限LOD（
SymbolmA@ g/L）
氯丙那林 Clp5～1000.99310.2马步特罗 Mabu5～1000.99570.2克伦特罗 Clen5～1000.99620.2莱克多巴胺 Rac5～1000.99250.5
B＋10SD获得本方法对4种β-受体激动剂的检出限和定量限（表3）。取添加不同浓度β-受体激动剂的猪尿液，通过MIP固相萃取小柱富集和净化后衍生，GC-MS 分析结果见表4。由表4可见，分析方法重复性良好，相对标准偏差为2.5%～9.3%; 不同盐酸克伦特罗加入量的加标回收率在71.0%～89.3%之间。
3.4 方法应用
克伦特罗和莱克多巴胺阳性尿样经MIP固相萃取柱富集和净化后，应用BSTFA＋1% TMS进行衍生化，GC-MS进行检测，结果见表5。在优化条件下，本方法的精密度较好，相对标准偏差低于5%。在实际样品测定过程中，通过空白尿液添加回收进行检测结果质量控制，尿液中克伦特罗和莱克多巴胺的添加浓度为10
SymbolmA@ g/L，回收率分别为87.4%和75.2%。
References
1 Lichtenstein A H, Deckelbaum R J. Circulation, 2001, 103（8）: 1177～1179
2 Debrauwer L, Bories G. Anal. Chim. Acta, 1993, 275（122）: 231～239
3 Koole A, Jetten A C, Luo Y, Franke J P, Zeeuw R A. J. Anal. Toxicol., 1999, 23（7）: 632～635
4 WU Yin-Liang, YANG Ting, SHAN Ji-Hao, HUANGFU Wei-Guo. Chinese J. Anal. Chem., 2010, 38（6）: 833～837
吴银良， 杨 挺， 单吉浩， 皇甫伟国. 分析化学， 2010, 38（6）: 833～837
5 Brambill G, Fiori M, Curiel I, Serpe L, Gallo P. Analyst, 1998, 123（12）: 2693～2696
6 Toorisaka E, Uezu K, Goto M, Furusaki S. Biochemical Engineering Journal, 2003, 14（2） : 85～91
7 Chianella I, Piletsky S A, Tothill I E, Chen B, TurnerA P F. Biosensors and Bioelectronics, 2003, 18（2）: 119～127
8 Anders B, Christine B, Anna H, Fredrik L, Borje S, Kees E. J. Chromatogr. A, 2002, 975（1）: 157～164
9 Christine W, Fredrik L, Maurizio F, Cinzia C, Sabrina M. Gianfranco B. J. Chromatogr. B, 2004, 804（1）: 85～91
10 Kootstra P R, Kuijpers C J, Wubs K L, Doorn D, Sterk S S, Ginkel L A, Stephany R W. Anal. Chim. Acta, 2005, 529（1-2）: 75～81
11 WANG Pei-Long， FAN Li， SONG Rong， GAO Sheng. Chinese J. Anal. Chem.，2007, 35（9）: 1319～1322
王培龙，范 理，宋 荣，高 生. 分析化学, 2007, 35（9）: 1319～1322
Determination of Four Kinds of β-Agonists in Swine Urine by
Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction Followed Gas
Chromatography Coupled Mass Spectrometry
WANG Pei-Long, FAN Li, SU Xiao-Ou, YE Zhi-Hua.
（Institute of Quality Standards and Testing Technologies for Agro-products,
Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081， China）
Abstract A simple and rapid method for the determination of β-agonists including Clorprenaline, Mabuterol, clenbuterol and ractopamine in swine urine by using molecular imprinted solid phase extraction followed with gas chromatography-mass spectrometry has been developed. 4 β-Agonists in swine urine were concentrated and cleaned-up by using molecularly imprinted polymer（MIP） solid phase extraction cartridge, the comparison study of clean up effect for the MIP and common solid phase extraction cartridge was carried out. Then the purified sample was derivatized by using N,O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide （BSTFA） containing 1% trimethylchlorosilane （TMCS） and were determined by gas chromatography-mass spectrometry （selected ion mode）. Under the optimized conditions, there is a good linear correlation （the calibration coefficient is above 0. 99） between the ratio of peak areas and the concentration of β-agonists in the range of 5－100
SymbolmA@ g/L. the limit of quantitative （LOQ） is 0.5
SymbolmA@ g/L for ractopamine and 0.2
SymbolmA@ g/L for other β-agonists in swine urine samples, the recoveries of different quantities of the β-agonists spiked in swine urine are between 75.1% and 97.5% , the relative standard deviations （RSD） are below 10%. The developing method was applied to the determination of clenbuterol and ractopamine in real urine samples, the precision of the results is good, the manipulation of the developed method is simple and fast comparing to other methods.
Keywords Molecular imprinted solid phase extraction; β-Agonists; Gas chromatography-mass spectrometry
（Received 30 June 2011; accepted 26 August 2011）