流动注射在线预富集-高效液相色谱法测定水产品中4种磺胺类药物

摘 要 建立了以活性碳纤维作吸附剂，流动注射在线预富集与高效液相色谱联用法测定水产品中4种磺胺类药物（磺胺噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹GFDA1啉）残留含量的方法。样品经磷酸盐缓冲溶液提取后，采用活性碳纤维作吸附剂流动注射在线预富集，在pH 3.0的甲酸溶液-甲酸甲醇溶液（60∶40, V/V）的流动相体系中， 用Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5

SymbolmA@ m）分离，流速1.0 mL/min；检测波长270 nm。结果表明, 4种磺胺类药物在0.001～0.064 mg/L浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数r为0.9997～0.9999；检出限为0.48～1.15

SymbolmA@ g/L（S/N＝3）；富集倍数在137～406之间；加标回收率为93.5%～104.0%。本方法操作简便、结果准确、灵敏度高。

关键词 流动注射；在线预富集；高效液相色谱；磺胺类药物

2011-06-23收稿；2011-09-09接受

本文系国家青年科学基金（No. 20905057）资助

* E-mail：yanrq@tzc.省略

1 引 言

磺胺类药物是以对氨基苯磺酰胺为基本化学结构的一类合成抗菌药物。通过任何途径摄入的磺胺类药物都会在人体中蓄积，对人类的身体健康产生危害[1～3]。欧盟将磺胺类药物列为必须严格监控药物，并制定动物源食品中磺胺类药物的最大残留限量为0.1 mg/kg。我国农业部第235号文件也规定其总残留限量为100

SymbolmA@ g/kg[4～6]。

目前，残留磺胺类药物的测定方法主要有液液萃取-液相色谱[7,8]\,固相萃取-高效液相色谱法［9～11］等。液液萃取法耗时、费力、低效、污染大，并且萃取液常会出现乳化现象；固相萃取作为一种新型的样品处理技术，虽具有低污染、低成本、高效、高选择性、不易乳化等优点，但操作步骤繁琐，富集效率受水样过柱速度影响较大，样品前处理时间较长。流动注射预富集作为一种集采样、萃取和富集于一体的样品前处理方法，不仅能够克服液液萃取和固相萃取的缺点，而且操作简单、快速，并能有效排除基体成分干扰，提高测定的准确度和灵敏度，同时能改善精密度[12]。本研究采用流动注射在线预富集-高效液相色谱法，建立了同时测定磺胺噻唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺喹GFDA1啉含量的有效方法。

Symbol`@@

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；流动注射分析处理仪（北京吉天仪器有限公司）；DELTA320 pH计（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；Milli-Q纯水超纯水系统（密理博中国有限公司）。

磺胺噻唑（ST）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺间甲氧嘧啶（SMM）、磺胺喹GFDA1啉（SQ）均为标准品（美国Supelco公司）；甲醇（色谱纯，TEDIA公司）；正己烷（分析纯，中国上海试剂总厂）；KH2PO4和K2HPO4（分析纯，上海化学试剂有限公司）；H2PO4、甲酸（分析纯，无锡市展望化工试剂有限公司）；超纯水由纯水机制得。

2.2 实验条件

2.2.1 样品制备和前处理方法 草鱼：去鳞、去皮，沿背脊取肌肉部分；水潺：去头，取可食肌肉部分；大竹蛏：去外壳，取可食部分；虾：去头、去壳，取可食部分。取后洗净晾干水分，切成碎块，经电动匀浆机充分匀浆后制得样品。准确称取约4 g样品，加30 mL磷酸盐缓冲液，涡旋振荡3 min后，40 ℃超声提取20 min，于50 mL离心管中以4000 r/min离心10 min；取上层清液，加10 mL正己烷脱脂；下层离心沉淀物抽滤，用少量磷酸盐缓冲液洗涤；合并水层，用流动相定容至250 mL，实验前调至pH 3.0。

2.2.2 流动注射在线富集原理及条件 采用预先装好活性碳纤维吸附剂的预富集圆形柱（实验室自制）代替液相色谱手动进样器的定量环进行在线富集。六通阀在“Load”状态下将样品溶液或者标准溶液通过聚四氟乙烯泵管富集到预富集圆形柱中活性碳纤维上，流动注射泵参数为240 s， 60 r/min；将六通阀在“Load”状态转到“Inject”位置，吸附在活性碳纤维上的待分析样品通过流动相进行洗脱至色谱柱进行分离分析。洗脱时间1.5 min，洗脱完成后，将六通阀转到“Load”状态，进行下一个待测试液的富集。

2.2.3 色谱分离条件 Eclipse XDB-C18色谱柱 （250 mm×4.6 mm，5

SymbolmA@ m，美国安捷伦科技有限公司）；流动相：甲酸-甲酸甲醇溶液（60∶40，V/V, pH 3.0）；流速：1.0 mL/min；检测波长：270 nm。

2.3 溶液的配制准确称取磺胺噻唑、磺胺二甲嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶标准品各约40 mg，磺胺喹GFDA1啉标准品约160 mg（精确至0.1 mg），用水超声溶解并定容至2000 mL，得磺胺混合标准储备液，备用。

分别精确移取25， 50， 100， 200和400

SymbolmA@ L磺胺混合标准储备液至500 mL容量瓶中，用流动相定容，所得系列混合标准溶液，避光冷藏保存。

磷酸盐缓冲液：8.0 g KH2PO4和2.0 g K2HPO4，用水溶解并定容至1000 mL。

3 结果与讨论

3.1 在线预富集参数的确定

用中间浓度的混合标准溶液考察预富集参数，先固定泵速60 r/min（流量约4.5 mL/min），尝试了泵转时间为60～600 s，进行样品装载，以0.8～2.5 min的不同洗脱时间进行洗脱。峰面积随装载时间和洗脱时间的变化见图1。

由图1可见。当洗脱时间少于 1.5 min，装载时间少于 240 s时，峰面积随着装载时间的延长而基本上呈线性增加，4种待测物能完全分开，且有良好的峰形；当装载时间大于 300 s时，峰面积虽有所增加，但是不呈线性增加。当洗脱时间大于1.5 min时，随着装载时间的延长，信号有所增加，但是峰形出现拖尾现象，分离效果变差，且洗脱时间越长，拖尾越严重。综合考虑，确定富集参数为：

图1 峰面积与装载时间（T）、洗脱时间（t）的关系

Fig．1 Relation of peak area vs. loading time and elution time

A． 磺胺噻唑； B. 磺胺二甲嘧啶； C. 磺胺间甲氧嘧啶； D. 磺胺喹GFDA1啉。A. Sulfathiazole; B. Sulfamethazine; C. Sulfa-

monomethoxine; Sulfaquinoxaline. 洗脱时间（Elution time）: 1， 0.8 min; 2， 1.2 min; 3， 1.5 min; 4， 2.0 min; 5， 2.5 min。泵速60 r/min，泵转时间240 s，洗脱时间1.5 min。

3.2 流动相及流速的选择

由于活性碳纤维易溶于乙腈，实验选择了甲醇和水二元流动相。分别尝试了甲醇-水、甲醇-乙酸、甲醇-甲酸等不同体系、不同pH值（2.0～6.0）及不同体积配比的流动相，并对流速从0.6～1.5 mL/min之间进行实验。结果表明，当流动相为甲酸-甲酸甲醇溶液（60∶40，V/V，pH＝3.0），流速为1.0 mL/min时，不但能得到良好的峰形、适当的保留时间，同时能对各分析物质得到较好的分离。这是由于磺胺类药物结构中带有氨基，呈弱碱性，其中性分子与其离子形式在有机相和水相中分配性质不同， 图2 定性分析谱图

Fig．2 Chromatogram of sulfonamides

ST. 磺胺噻唑（Sulfathiazole）； SM2. 磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine）； SMM. 磺胺间甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine）； SQ. 磺胺喹GFDA1啉（Sulfaquinoxaline）。因此在键合相是反相的色谱情况下，在流动相中加入一定比例的酸性溶液，使磺胺类药物在流动相中呈离子形式存在，同时在流动相中加入酸有助于色谱柱内硅胶硅醇基的质子化，消除硅醇基与磺胺之间的相互作用，减少峰拖尾，改善磺胺的色谱峰形和分离效果。经在线富集后定性分析见图2。

3.3 样品提取条件的选择

由于磺胺类药物难溶于水，较易溶于稀酸、稀碱和有机溶剂[13～15]。本实验分别对比了3种试剂对约4.0 g加标虾样品中磺胺药物的提取效果。3种提取溶剂分别为30 mL甲醇、30 mL磷酸盐缓冲液、30 mL 0.1% H3PO4溶液。提取效果见表1。由表1可知，甲醇与磷酸盐缓冲液的提取效果较好；0.1% H3PO4溶液的提取效果较差。但由于甲醇毒性较大，故选择了磷酸盐缓冲液作为提取液。

表1 不同提取液的提出效果对照表

Table 1 Extraction effect of different extractants（%）

提取剂Extratants基线Baseline回收率 Recovery （%）STSM2SMMSQ

甲醇 Methanol平衡 Balance90.894.1105.4100.2

磷酸盐缓冲液Phosphate buffer solution平衡 Balance100.1101.599.8100.8

0.1% H3PO4漂移Drift55.860.400

3.4 线性范围、检出限、定量限、精密度及富集倍数

对5个梯度浓度的混合标准溶液在线富集后分析测定，根据质量浓度-峰面积作图，得其线性关系和相关系数。按照仪器基线噪声的3倍（S/N＝3）求得所测4种磺胺类药物的检出限LOD和水产品样品中4种磺胺类药物的定量限LOQ（S/N＝10）。另外配制了峰面积在经富集后的工作线性范围内的5个标准浓度溶液，采用直接进样方式，根据质量浓度-峰面积作图，得4条工作曲线，利用斜率之比求得富集倍数。结果见表2。

4 结 论

采用活性炭纤维流动注射在线预富集-高效液相色谱同时测定水产品中4种磺胺类药物，实现了集采样、富集于一体的新的样品前处理方法。有效排除了基体成分干扰，简化了样品前处理过程。结果表明：待测组分能有效分离，4种磺胺类药物线性关系良好，回收率高，精密度好，且不受样品中其它组分的干扰，取得了较好的实验效果，适用于在日常生活中检测其它水产品中磺胺类药物的含量。

References

1 JIANG Feng, LIU Xiao-Yu. Academic Periodical of Farm Products Processing, 2009, （5）: 60～63

江 丰, 刘晓宇. 农产品加工, 2009, （5）: 60～63

2 CAI Chun-Ping, WANG Jia-Ying, ZHENG Jie, WANG Dan-Hong, WU Wen. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2009, 43（5）: 44～48

蔡春平, 王家颖, 郑 洁, 红, 吴 文. 中国兽药杂志, 2009, 43（5）: 44～48

3 ZHANG Chang-Kun, WANG Mao-Jian, REN Li-Qiang, SUN Yu-Zeng, LIU Hui-Hui. Shandong Fisheries, 2008, 25（10）: 59～61

张长坤, 王茂剑, 任利强, 孙玉增, 刘慧慧. 齐鲁渔业, 2008, 25（10）: 59～61

4 Council Regulation （EEC） No.2377/90 of 26 June 1990 Laying Down a Community Procedure for the Establishment of Maximum Residue Limits of Veterinary Medicinal Products in Foodstuffs of Animal Origin [S]

5 WU Yong-Ning, SHAO Bing, SHEN Jian-Zhong. Detection and Supervising Techniques of Veterinary Drug Residues. Beijing: Chemical Industry Press, 2007： 189～218

吴永宁, 邵 兵, 沈建忠. 兽药残留检测与监控技术. 北京: 化学工业出版社, 2007： 189～218

6 LI Jun-Suo, QIU Yue-Ming, WANG Chao. Analysis of Veterinary Drug Residues. Shanghai: Shanghai Scientific and Technical Publishers, 2002: 228～255

李俊锁, 邱月明, 王 超. 兽药残留分析. 上海: 上海科学技术出版社, 2002: 228～255

7 LI Xue-De, XIAN Qi-Ming, LIU Hong-Ling, HUA Ri-Mao, XU Shan-Shan, CHEN Hai-Yan, YU Hong-Xia. Chinese J. Anal. Chem., 2010, 38（3）: 429～433

李学德, 鲜明, 刘红玲, 花日茂, 许珊珊, 陈海燕, 于红霞. 分析化学, 2010, 38（3）: 429～433

8 WU Cui-Qin, CHEN Di-Yun, ZHOU Ai-Ju, DENG Hong-Mei, LIU Yong-Hui. Chinese J. Anal. Chem., 2011, 39（1）: 17～21

吴翠琴, 陈迪云, 周爱菊, 邓红梅, 刘永慧. 分析化学, 2011, 39（1）: 17～21

9 MA Li-Li, GUO Chang-Sheng, HU Wei, SHA Jian, ZHU Xing-Wang, RUAN Yue-Fei, WANG Yu-Qiu. Chinese J. Anal. Chem., 2010, 38（1）: 21～26

马丽丽, 郭昌胜, 胡 伟, 沙 健, 朱兴旺, 阮悦斐, 王玉秋. 分析化学, 2010, 38（1）: 21～26

10 BAO Yan-Ping, LI Yan-Wen, MO Ce-Hui, YAO Yuan, TAI Yi-Ping, WU Xiao-Lian, ZHANG Yan. Environmental Chemistry, 2010, 29（3）: 513～518

包艳萍, 李彦文, 莫测辉, 姚 园, 邰义萍, 吴小莲, 张 艳. 环境化学, 2010, 29（3）: 513～518

11 GUO Wei, LIU Yong, LIU Ning, WEI Dong-Xu. Chinese J. Anal. Chem., 2009, 37（11）: 1638～1644

郭 伟, 刘 永, 刘 宁, 魏东旭. 分析化学, 2009, 37（11）: 1638～1644

12 CHEN Su-Qing, LIANG Hua-Ding, HUANG Wei-Ya, HAN De-Man, WANG Xi-Mei. Chinese J. Anal. Chem., 2008, 36（7）: 959～963

陈素清, 梁华定, 黄微雅, 韩德满, 王习梅. 分析化学, 2008, 36（7）: 959～963

13 LI Yan-Wen, MO Ce-Hui, ZHAO Na, ZHANG Rui-Jing, YI Ru-Han. Chinese J. Anal. Chem., 2008, 36（7）: 954 ～958

李彦文, 莫测辉, 赵 娜, 张瑞京, 亦如翰. 分析化学, 2008, 36（7）: 954 ～958

14 EPA-821-R-08-002. Method 1694: Pharmaceuticals and Personal Care Products in Water, Soil, Sediment, and Biosolids by HPLC/MS /MS. U. S. Environmental Protection Agency Office of Water Office of Science and Technology Engineering and Analysis Division （4303T）, 2007

15 YANG Fang, LI Yao-Ping, QIAN Jiang, LI Xiao-Jing. Analysis and Testing Technology and Instruments, 2004, 10（4）: 234～237

杨 方, 李耀平, 钱 疆, 李小晶. 分析测试技术与仪器, 2004, 10（4）: 234～237

Determination of Four Kinds of Sulfonamides in Aquatic Products by

Flow Injection On-line Preconcentration and High

Performance Liquid Chromatography

LIU Gui-Hua, HAN De-Man, LIANG Hua-Ding, TANG Shou-Wan, PAN Fu-You, YAN Rui-Qiang.*

（School of Pharmaceutical and Chemical Engineering, Taizhou University, Linhai 317000， China）

Abstract Using activated carbon fibre as the absorbent, a flow injection on-line preconcentration-high performance liquld chromatographic method for the determination of four kinds of sulfonamides （sulfathiazole, sulfamethazine, sulfamonomethoxine and sulfaquinoxaline） in aquatic products was established. The samples were extracted by phosphate buffer solution, then preconcentrated on activated carbon fibre by flow injection. The separation was carried out with an Eclipse XDB-C18 column （250 mm×4.6 mm, 5

SymbolmA@ m） in the mobile phase system of formic acid solution-formic acid methanol solution （60∶40， V/V） at pH＝3.0, the flow rate was 1.0 mL/min . The detection was performed at 270 nm wavelength. The experiment result showed that the good linear relationship was obtained in the sulfonamides concentrations from 0.001－0.064 mg/L with the correlation coefficient from 0.9997 to 0.9999. The detection limit was 0.48－1.15

SymbolmA@ g/L（S/N＝3）. The enrichment factors for the four sulfonamides were from 137 to 406. The recoveries were 93.5%－104.0%. This method was easy to operate with precise result and good repetition and can be successfully applied to the determination of sulfathiazole, sulfamethazine, sulfamonomethoxine and sulfaquinoxaline.

Keywords Flow injection; On-line preconcentration; High performance liquid chromatography; Sulfonamides

（Received 23 June 2011; accepted 9 September 2011）