原子转移自由基聚合法制备新型亲水作用色谱固定相及其性能评价

摘 要 以自制的6.0 SymbolmA@ m单分散大孔交联聚氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯（Poly（4-vinylbenzylchloride-co-divinylbenzene），PCMS/DVB）微球为基质和引发剂，CuCl和自行合成的三[（2-二甲基氨基）乙基]胺（Tris[2-（dimethylamino）ethyl]amine, Me6TREN）组成混合催化体系，使4-乙烯基吡啶（4-Vinyl pyridine, 4-VP）在甲苯中进行原子转移自由基聚合，制得4-乙烯基吡啶聚合物，单体4-乙烯基吡啶的接枝率为8.55%。将该聚合物与正溴丁烷反应制得新型亲水色谱固定相。在亲水作用色谱模式下，流速1 mL/min，乙腈-水为流动相可分离5种芳胺化合物和4种酚类化合物。在离子交换色谱模式下，6 mmol/L Na2CO3-5.5 mmol/L NaHCO3为淋洗液可分别分离5种无机阴离子和4种短链有机酸。结果表明，此固定相对极性化合物和无机阴离子具有良好的分离性能，是一种性能优异的亲水作用色谱固定相。

关键词 原子转移自由基聚合法; 单分散大孔交联聚氯甲基苯乙烯-二乙烯苯微球; 亲水作用色谱; 芳胺和酚类化合物; 无机阴离子

2011-05-30收稿；2011-08-18接受

本文系科技部重大基础研究前期专项（No. 2009CB626608）, 国家自然科学基金（No. 21065008）和宁夏自然基金资助（No. NZ0838）

* E-mail: gongbl@nxu.省略

1 引 言

色谱柱填料作为高效液相色谱（HPLC）的核心。提高色谱填料的柱效、柱容量、增大填料的pH使用范围，具有多种分离模式以及对环境友好， 将成为色谱填料的发展方向。

亲水作用色谱（HILIC）作为一种分离极性化合物的液相色谱模式，其概念是由Alpert[1]于1990年提出的。HILIC是一种以极性固定相（如硅胶、氨基键合硅胶等）及水-极性有机溶剂为流动相的色谱模式[2]，它与正相色谱相似，水是强溶剂，极性化合物比非极性化合物的保留时间长，与反相色谱的保留顺序恰好相反。强极性化合物的分离问题引起了各个研究领域的重视，如药物分析、代谢组学、蛋白质组学等研究领域都不同程度地涉及强极性化合物的分离问题，近年来，HILIC 越来越受到关注和重视[3]。Liang等[4]使用“点击化学（Click chemistry）”合成了HILIC固定相，制备了一系列以醇羟基为功能基团的HILIC固定相，用于分离碱基、核苷以及中药中的强极性组分并取得了较好的效果。韩超等[5]以二醇基硅胶为固定相，研究了绿原酸，阿魏酸等有机酸的HILIC保留机理。

原子转移自由基聚合法（ATRP）是近年发展起来的一种新型聚合技术，具有修饰密度高、高聚合物链端可控等优点，为克服现有固定相及其制备技术存在的缺陷提供了可能。ATRP集中了自由基聚合和活性聚合的优点，条件温和，操作较简单，已经获得了许多新型聚合物。通过ATRP法在硅胶载体表面成功地合成嵌段、多枝聚合物[6]。同时，采用ATRP方法制备热敏性聚合物也成为近年的研究热点，如在硅胶表面聚合N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAM）温敏型嵌段聚合物[7,8]。用ATRP技术制备离子色谱固定相的研究才起步，但已经表现出优异的应用潜力。Unsal等[9]用ATRP技术制备的强阳离子交换固定相柱容量比传统方法有大幅度提高。Hemstroem等[10]用ATRP技术制备的反相色谱分离介质具有优异的抗水解性能。王婀娜等[11]采用ATRP技术将甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵聚合于硅胶表面，制得了强阴离子交换色谱填料，用于酸性蛋白质的分离，取得了很好的效果。所以，采用ATRP技术，用有机聚合物对固体材料表面修饰是极具发展潜力的分离介质制备技术。

本研究采用ATRP聚合法将4-VP接枝到单分散大孔交联PCMS/DVB微球表面，对其进行化学改性后制备新型色谱固定相。在亲水作用色谱模式和离子色谱模式下，分别对芳胺、酚类化合物及无机阴离子、短链有机酸进行了分离研究。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；CGY-100型高压气动泵（北京福思源机械加工部）；Dionex ICS-90离子色谱仪；Dionex CSRS-I（4 mm）抑制器；JY-92超声波细胞破碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；KQ-250B超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；生物显微镜（美国JEOL公司）；扫描电子显微镜（1000B, 美国）；LD5-2A型低速离心机（北京医用离心机厂）。

氯甲基苯乙烯（CMS）、二乙烯基苯（DVB），购于阿拉丁试剂有限公司；苯乙烯（St）、乙二胺四乙酸钠（EDTA）、过氧化苯甲酰（BPO）、甲苯（上海试剂一厂）；聚乙烯醇（PVA，醇解度为88%，天津大学化工实验厂），以上试剂均为化学纯。氯化亚铜（CuCl）、N,N-二甲基苯胺、二苯胺、对甲苯胺、α-萘胺、间硝基苯胺、甲酚、乙萘酚、邻苯二酚，间硝基酚（阿拉丁试剂有限公司）；三[（2-二甲基氨基）乙基]胺（ Me6TREN）根据文献[12]合成。其它试剂均为分析纯。

2.2 单分散交联聚氯甲基苯乙烯―二乙烯苯微球的合成[13]

取适量聚苯乙烯种子液，加适量十二烷基硫酸钠（Sodium lauryl sulfate, SDS）于30 ℃水浴搅拌； 图1 交联聚氯甲基苯乙烯-二乙烯基苯微球的电镜照片

Fig．1 Scanning electron micrograph of the monosized porous poly（4-vinylbenzylchloride-co-divinylbenzene） （PCMS/DVB） beads另取适量氯甲基苯乙烯、二乙烯苯、过氧化苯甲酰、甲苯及邻苯二甲酸二丁酯，超声乳化至无油滴时，迅速转入种子液体系中，于30 ℃恒温水浴中搅拌溶胀10～15 h，在此过程中，间隔性地在显微镜下，观察种子表面是否溶胀，然后升温至70 ℃聚合24 h,待聚合反应完成后，将产物用热水反复洗涤，再分别用乙醇、丙酮洗涤数次，在索氏提取器中用甲苯抽48 h，即得到粒径为5.0～10.0

SymbolmA@ m的单分散聚氯甲基苯乙烯-二乙烯苯微球，可取少量在显微镜下观察其形态及大小。控制单体、交联剂等影响微球粒径大小的量，制备6.0

SymbolmA@ m PCMS/DVB微球，微球的孔径分布采用BET法测定，其平均孔径14.9 nm,比表面积为80 m.2/g。图1为粒径为6.0

SymbolmA@ m PCMS/DVB微球的电镜照片。

2.3 PCMS/DVB微球表面接枝聚4-VP制备亲水作用色谱固定相

室温下，在干燥100 mL两颈烧瓶中依次加入4-VP单体，催化剂（CuCl），配体（Me6TREN），其物质的量之比为100∶2∶4.5，然后再加入2 g PCMS/DVB微球和50 mL甲苯，超声，反复抽真空、充氮气循环多次后密封。在45 ℃油浴中反应24 h，反应结束后，依次用乙二胺四乙酸二钠溶液、水、乙醇、丙酮洗涤后，40 ℃真空干燥，制得PCMS/DVB微球表面接枝聚4-VP聚合物。称取2 g该聚合物，加入50 mL甲苯，3 mL正溴丁烷，在室温下搅拌24 h，制得新型亲水作用色谱固定相。合成路线见图2。

图2 亲水作用色谱固定相的合成路线

Fig．2 Scheme for the synthsis of hydrophilic interaction liquid chromatographic（HILIC） stationary phase

2.4 色谱柱的装填及色谱条件

以水为匀浆液和顶替液，在30 MPa压力下以匀浆法将亲水作用色谱填料装入不锈钢柱管（15 cm×0.46 cm I.D. ）中。液相色谱条件：乙腈-水为流动相，等度洗脱，检测波长：254 nm。离子色谱条件：淋洗液为6 mmol/L Na2CO3＋5.5 mmol/L NaHCO3，再生液为36 mmol/L H2SO4，使用前经0.45

SymbolmA@ m滤膜过滤；进样体积 10

SymbolmA@ L。所有流动相在使用前均经0.45

SymbolmA@ m滤膜过滤。

3 结果与讨论

3.1 亲水作用色谱固定相接枝率的表征

表1给出PCMS/DVB 微球和4-VP单体接枝PCMS/DVB 微球的元素分析数据。由表1可见，4-VP接枝PCMS/DVB微球中N元素的含量明显增加，表明4-VP已成功接枝到PCMS/DVB微球表面。比较4-VP-PCMS/DVB与色谱固定相C, H和N含量变化，可以确定正溴丁烷已与4-VP-PCMS/DVB发生化学反应。通过公式（1）计算接技率（Graftrate, GR）[14]。

GR（%）＝100×Np（10.3）Np（cal）×（1

Symbolm@@ Np/Np（cal））×S（1）

式中Np表示N元素在PCMS/DVB微球上增加的百分量， Np（cal）是4-VP单体中N元素的百分含量，S表示聚合物固定相的比表面积（m.2/g）。计算得4-VP的接枝率为8.55%。

表1 元素分析数据

Table 1 Data of elemental analysis

样品Sample元素含量Element content （%, w/w）碳（C）氢（H）氮（N）4-乙烯基吡啶的接枝率

4-Vinylpyridine graft rate （%）

PCMS/DVB微球 PCMS/DVB beads 45.776.4110.031－

4-乙烯基吡啶聚合物 4-Vinylpyridine polymer46.396.0111.1718.55

亲水作用色谱固定相 HILIC stationary phase47.246.0350.659

PCMS/DVB： Poly（4-vinylbenzye-chloride-co-divinylbenzene）.

3.2 固定相在亲水作用色谱模式下分离性能考察

3.2.1 芳胺化合物的分离性能考察 HILIC对极性化合物具有很好的保留和分离选择性，是解决各类极性化合物分离的可靠手段[15]。 本研究以乙 图3 亲水作用色谱模式下芳胺化合物的色谱分离图

Fig．3 Chromatogram for separation of amines by HILIC mode

流速（Flow rate）：1.0 mL/min; 流动相（Mobile phase）：乙腈（Acetonitrile）-水（Water） （15∶85, V/V），检测波长（λ）： 254 nm。1. N,N-二甲基苯胺（N,N-Dimethylaniline），2. 二苯胺（Diphenylamine），3. 对甲苯胺（p-Toluidine），4. α-萘胺 （α-Naphthylamine），5. 间硝基苯胺（m-Nitroaniline）。腈-水（15∶85, V/V）为流动相，在流速为1.0 mL/min的条件下, 分别对5种芳胺化合物进行分离。由图3可知，5种胺类化合物在该固定相上被依次洗脱，洗脱的顺序与胺类化合物的碱性一致。碱性越强，保留越弱。

3.2.2 流动相中水含量对芳胺类化合物保留行为的影响 图4是流动相中不同水含量对5种芳胺化合物保留影响。从图4可见，当流动相中水含量从40%增加到90%（V/V）时，5种溶质的保留因子逐渐降低，符合亲水作用保留机理，此结果与文献一致[1,16～19]。随着流动相中水含量增大，芳胺化合物的保留逐渐减弱，尤其对α-萘胺的保留影响最大。结构中有吡啶环芳香结构，另外，吡啶环接上正溴丁烷后，N为正离子结构，因此该固定相与溶质之间存在静电引力、π-π作用。流动中的水与溶质间存在氢键作用，随着流动相中水含量逐渐增大，减弱了芳胺与固定相之间的作用，溶质的保留逐渐减弱。

3.2.3 酚类化合物分离性能考察

图5是以乙腈-水为流动相时4种酚类化合物的色谱分离图，溶质在固定相上的保留顺序与溶质的酸性强弱有关，溶质酸性越强，在固定相上的保留越强。上述保留关系与溶质和固定相间的静电引力、π-π等相互作用有关。

图4 流动相中不同水含量对芳胺保留时间的影响

Fig．4 Effect of water content in mobile phase on retention time of amines

流速（Flow rate）： 1.0 mL/min； 流动相（Mobile phase）：水含量由40%增加到90%（The water content increases from 40% to 90%），检测波长（λ）: 254 nm。1. N,N-二甲基苯胺（N,N-Dimethylaniline）， 2. 二苯胺（Diphenylamine）， 3. 对甲苯胺（p-Toluidine）， 4. α-萘胺（α-Naphthylamine），5. 间硝基苯胺（m-Nitroaniline）。

图5 酚类化合物的分离图

Fig．5 Chromatogram for separation of hydroxylbenzenes by HILIC mode

流速（Flow rate）：1.0 mL/min，流动相（Mobile phase）-乙腈（Acetonitrile）-水（water） （25∶75, V/V），检测波长（λ）：254 nm。1. 甲酚（p-Cresol）； 2. 乙萘酚（β-Naphthol）； 3. 邻苯二酚（Pyrocatechol）； 4. 间硝基酚（m-Nitrophenol）。

3.3 固定相在离子交换色谱模式下分离性能考察

3.3.1 无机阴离子分离性能考察 为考察填料的离子交换色谱性能，选用6.0 mmol/L Na2CO3-5.5 mmol/L NaHCO3为淋洗液，在流速为1.0 mL/min的条件下，对5种无机 图6 无机阴离子色谱分离Symbolm@@ 3，这与常见无机阴离子的亲水性强弱顺序一致。在疏水性较强的色谱固定相上，离子大小对保留的影响通常大于离子的价数。固定相上带有芳香性的六元杂环，该环与正溴丁烷反应后，使得填料的表面带有电荷，与无机阴离子具有静电引力作用。离子半径大，电子云密度比较大的离子，保留较强。平行进样10次，不同离子的出峰时间、峰高和峰面积具有良好的重现性。

3.3.2 线性关系和检出限测定

在上述色谱条件下，进样量10

3.3.3 4种短链有机酸分离性能考察 离子交换色谱模式下分离有机酸，能避免样品中其它非离子性有机物的干扰。有机酸在水溶液中部分离解成COO.

Symbolm@@ ，与阴离子色谱填料的功能基相交换而被保留。

根据各种有机酸离解度、荷电性、亲水性等性质的差异而将其进行色谱分离。本研究采用自制亲水作用色谱柱分别对甲酸、乙酸、一氯乙酸和草酸进行分离，分离结果见图7。从图7可见，4种有机酸在10 min内被分离, 但草酸峰宽，电导响应值较低。

3.3.4 pH值对无机阴离子分离性能影响 淋洗液的pH值影响离子交换功能基、溶质离子的存在形式，

影响保留。本研究固定NaHCO3的总浓度不变，通过加入H3BO3和NaOH改变淋洗液的pH值，考察不同pH值下无机阴离子的保留行为变化，结果见图8。从图8可见，在pH＝8.0～10.0范围内，随着pH值的增大，各种无机阴离子的保留时间逐渐减小。这是因为H3BO3的加入，使得H2CO3的离解平衡向左进行。HCO.

Symbolm@@ 3的洗脱能力弱，无机阴离子的保留时间增长。当加入NaOH时，淋洗液中CO2

Symbolm@@ 3的浓度增大，淋洗液与阴离子交换树脂的亲和力增强，洗脱能力强。本研究在pH＝8.25时，各无机阴离子得到最佳分离。

4 结 论

以6.0

SymbolmA@ m大孔单分散交联PCMS/DVB微球为基质和大分子引发剂，采用ATRP技术将4-VP成功的接枝到PCMS/DVB树脂上，将此树脂与正溴丁烷反应，制得新型色谱固定相。由于PCMS/DVB微球既是基质，又是大分子引发剂，使原子转移自由基聚合反应过程简化，引发效率提高。在亲水作用色谱模式下，可分离5种芳胺化合物和4种酚类化合物。在离子交换色谱模式下，可对5种无机阴离子和4种短链有机酸进行分离，且具有较好的线性关系和较低的检出限。

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Preparation of Hydrophilic Interaction Chromatographic Stationary Phase

Using Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization and

Its Chromatographic Properties

WANG Fu-Qiang, CHANG Su-Ping, DAI Xiao-Jun, GONG Bo-Lin.*

（Key Laboratory of Energy & Chemical Engineering, Ningxia University, Yinchuan 750021, China）

Abstract Atom transfer radical polymerization （ATRP） of poly-4-vinylpyridine-grafted PCMS/DVB beads were synthesized by using 6.0

SymbolmA@ m monodisperse macroporous poly（4-vinylbenzylchloride-co-divinylbenzene） （PCMS/DVB） beads as initiator, CuCl and tris［2-（dimethylamino）ethyl］ amine （Me6TREN） as catalyst and ligand in toluene. A new kind of hydrophilic interaction chromatographic （HILIC） stationary phase was synthesized by chemical modified of the poly-4-vinylpyridine-grafted PCMS/DVB beads. The grafting rate of poly-4-vinylpyridine was 8.55%. The column was tried as chroma-tographic packing for the separation of amines and hydroxybenzenes by HILIC modes and inorganic anions and organic acids by IC modes. The results showed that five amines and four hydroxybenzenes were completely separated in 10 min by acetonitrile-water as mobile phase with isocratic elution using the synthesized hydrophilic interaction chromatographic stationary phase. By using 6 mmol/L Na2CO3-5.5 mmol/L NaHCO3 as eluent, five inorganic anions and four organic acids had good linear relationship and low detection limit by IC model. The effect of water content in mobile phase on the retention of amines was evaluated. The stationary phase has good chromatographic properties for separation of polar compounds and inorganic anions.

Keywords Atom transfer radical polymerization method; Monodisperse macroporous poly （4-vinylbenzyl chloride-co-divinylbenzene） beads; Hydrophilic interaction chromatography; Separation of amines and hydroxybenzenes; Inorganic anions

（Received 30 May 2011; accepted 18 August 2011）