帕尼培南联合舒巴坦对鲍曼不动杆菌体外抗菌活性的研究

[摘要] 目的 探讨帕尼培南与舒巴坦联合应用对鲍曼不动杆菌体外抗菌活性的影响。 方法 选择帕尼培南敏感和耐药鲍曼不动杆菌各40株菌株，用微量肉汤稀释法及联合药敏棋盘法测定帕尼培南与舒巴坦单用及联合使用的MIC值，计算部分抑菌指数（∑FIC），确定两种药物的体外联合效应。 结果 帕尼培南敏感鲍曼不动杆菌联合使用帕尼培南及舒巴坦较单独用药MIC50及MIC90均下降了2个倍比稀释度，帕尼培南耐药菌株联合用药后MIC50及MIC90均下降了1个倍比稀释度；联合给药对帕尼培南敏感菌株的协同作用为30.0%（12/40），部分协同为45.0%（18/40），相加作用为15.0%（6/40）；帕尼培南耐药菌株结果显示协同作用为10.0%（4/40），部分协同为57.5%（23/40），相加作用为22.5%（9/40），2组无关作用均为10.0%（4/40），无菌株存在拮抗作用。 结论 帕尼培南联合舒巴坦在体外试验中对于鲍曼不动杆菌主要表现为协同和部分协同作用，两种药物联合较单药治疗能更有效地抑制鲍曼不动杆菌的生长。

[关键词] 鲍曼不动杆菌；帕尼培南；舒巴坦；棋盘法

[中图分类号] R378.99 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）13-0001-04

[Abstract] Objective To evaluate the synergy effect of panipenem combined sulbactam on vitro antibacterial activity of acinetobacter baumannii. Methods Forty strains of panipenem-susceptible and panipenem resistant acinetobacter baumannii were randomly selected respectively， and the minimum inhibitory concentration （MIC） values of panipenem and/or sulbactam were determined using microbroth dilution method and checkerboard method. The fractional inhibitory index （ΣFIC） were calculated， and then the vitro combination effect of panipenem and sulbactam were determined. Results Compared with the single drug group， in the combination group of panipenem and sulbactam， the MIC50 and MIC90 of panipenem-susceptible acinetobacter baumannii decreased two times in dilution， while the MIC50 and MIC90 decreased one times in dilution in panipenem-resistant strains. For the panipenem-susceptible strains， The combination of panipenem and sulbactam demonstrated 30.0% （12/40） synergism， 45.0% （18/40） partial synergism， 15.0%（6/40） additive， For the panipenem-resistant strains， the synergistic effect was 10.0%（4/40）， partially synergistic effect was 57.5% （23/40）， the additive effect was 22.5% （9/40）， and indifference effect of the two groups was 10.0% （4/40）. No strain had antagonistic effect. Conclusion In vitro tests， panipenem and sulbactam combination show synergism or partial synergism against most acinetobacter. baumannii isolates. Compared with the alone use， the combination of panipenem and sulbactam is more effective in inhibiting the growth of acinetobacter baumannii.

[Key words] Acinetobacter baumannii； Panipenem； Sulbactam； Checkerboard method

鲍曼不动杆菌（acinetobacter baumannii，AB）是院内感染最常见的条件致病菌之一，在高危人群中易引发严重感染，并常伴有其他细菌和（或）真菌的感染[1]。有报道鲍曼不动杆菌感染引起的病死率约7.8%～23.0%[2]。碳青霉烯类抗菌药物曾是治疗鲍曼不动杆菌感染最有效的一类药物，近年来随着广谱抗生素特别是碳青霉烯类药物的大量应用，鲍曼不动杆菌的耐药性日趋严重，多重耐药（multidrug-resistant，MDR）、广泛耐药（extensively drug resistant，XDR）、全耐药（pan drug resistant，PDR）鲍曼不动杆菌已呈世界性流行[3]。

目前，联合用药是治疗耐药鲍曼不动杆菌感染的有效策略。舒巴坦与亚胺培南、美罗培南、米诺环素等药物联合对增强鲍曼不动杆菌抗菌活性的研究不断有报道[4，5]，而舒巴坦与帕尼培南联合应用的研究几乎没有。本研究用棋盘法和微量肉汤稀释法测定评估帕尼培南与舒巴坦联合使用对碳青霉烯类敏感及耐药鲍曼不动杆菌的协同抗菌作用，以期为临床合理选择抗菌药物、有效治疗多重耐药的鲍曼不动杆菌提供更多的理论依据。

1 资料与方法

1.1 菌株来源

从2005年1月～2009年9月我院收集的鲍曼不动杆菌中随机选取40株帕尼培南耐药及40株帕尼培南敏感的鲍曼不动杆菌，均经生物梅里埃公司VITEK GNI重新鉴定为醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体，再由16S～23S rRNA间区序列测序鉴定到种。质控菌株为大肠杆菌ATCC25922。帕尼培南药敏折点参照CLSI2012亚胺培南和美罗培南对鲍曼不动杆菌的折点，敏感≤4 μg/mL，耐药≥16 μg/mL[4]。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 抗菌药物 帕尼培南（日本第一三共制药株式会社，含量：949 μg/mg）；舒巴坦（深圳市海滨制药有限公司，批号0030009072）；多黏菌素E、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦 3 种抗菌药物Etest条（瑞典AB Biodisk公司）；头孢吡肟、头孢他啶、哌拉西林、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、米诺环素纸片（英国Oxoid公司）。

1.2.2 仪器 VITEK2-Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统、VITEK2 DensiCHEK Plus比浊仪（法国生物梅里埃公司）；96孔平板；恒温箱；微量加样器。

1.2.3 试剂 Muller-Hinton（MH）肉汤；Muller-Hinton（MH）琼脂培养基（英国Oxoid公司）。

1.3 常用抗菌药物敏感性测定

头孢吡肟、头孢他啶、哌拉西林、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、米诺环素采用纸片扩散法测定药物敏感性，多黏菌素E、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦3种抗菌药物采用Etest条测定 MIC值。纸片扩散法结果及MIC结果按照CLSI2012判定标准[4]。

1.4 微量肉汤稀释法测定MIC值

微量肉汤稀释试验方法及结果判读遵循CLSI2012操作规程及标准[4]。根据各菌株帕尼培南和舒巴坦单药MIC值测定范围将抗菌药物储备液用阳离子调整MH肉汤在灭菌96孔平板上倍比稀释成一系列浓度[（0.016～512）μg/mL]，每孔稀释药液为100 μL。用接种环挑取生长于MH平板的新鲜菌落置于生理盐水中，调整浊度至0.5麦氏浊度，用MH肉汤1∶10稀释后接种5 μL至孔中，接种后每孔菌液最终浓度为5×105 CFU/mL，35℃温箱中孵育24 h，无细菌生长微孔中所含帕尼培南或舒巴坦药物最小浓度即为每一菌株的MIC结果。

1.5 棋盘法测定帕尼培南和舒巴坦联合药敏

2种药物按微量肉汤稀释法分别在96孔板的纵列和横列进行稀释，每孔加入帕尼培南药液50 μL和舒巴坦药液50 μL，稀释度根据2.3所得的各菌株帕尼培南和舒巴坦MIC值结果确定，最终得到2种药物倍比稀释后不同浓度的组合（2×MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC）。并随板留孔做单药微量肉汤MIC值测定。每孔接种1∶10 MH肉汤稀释0.5麦氏浊度菌液5 μL，最终菌液浓度为5×105 CFU/mL。35℃孵育24 h，观察结果，记录单药MIC帕尼培南单药、MIC舒巴坦单药及两药联合应用时各自的MIC帕尼培南联合、MIC舒巴坦联合。

1.6 部分抑菌指数（∑FIC）计算和判读标准

药物相互作用效应通过计算部分抑菌指数（Fractional inhibitory concentration， ∑FIC）来判断，计算公式及判断标准参照参考文献[5]。公式：∑FIC=MIC帕尼培南联合/MIC帕尼培南单药+MIC舒巴坦联合/MIC舒巴坦单药。∑FIC≤0.5为协同作用，0.5

1.7 统计学方法

采用SPSS18.0软件进行数据统计分析。将帕尼培南敏感组及耐药组细菌的单药MIC值及联合用药后的MIC值做对数转换后行配对t检验，判断联合用药后MIC值的下降是否有统计学意义。

2 结果

2.1 药敏结果

40株帕尼培南敏感鲍曼不动杆菌对所测试10种抗菌药物的耐药率除多黏菌素E外均在25%～45%，40株帕尼培南耐药鲍曼不动杆菌除对氨苄西林/舒巴坦耐药率为57.5%，多黏菌素E耐药率为15.0%以外，对其余8种抗菌药物的耐药率在85%～100%，见表1。

2.2 帕尼培南与舒巴坦联合使用后MIC值变化

经微量肉汤稀释法及棋盘法检测，40株帕尼培南敏感鲍曼不动杆菌单用舒巴坦和帕尼培南及2种药物联用后的MIC值变化见表2，联合用药后2种药物的MIC范围、MICG均有大幅度下降，MIC50及MIC90分别下降了2个倍比稀释度。40株帕尼培南耐药鲍曼不动杆菌单用舒巴坦和帕尼培南及2种药物联用后的MIC值变化见表3，与敏感菌株相似，联合用药后两种药物的MIC50及MIC90均下降了1个倍比稀释度。质控菌株ATCC25922的帕尼培南MIC值为0.125 μg/mL，舒巴坦MIC值为32 μg/mL。对80株细菌的MIC值均进行对数转换后进行配对t检验，以确定联合用药较单药的MIC值的下降是否有统计学意义，经检验，在帕尼培南敏感菌株中，舒巴坦联合用药后的MIC差值均数为0.69，标准差为0.42，t=10.27；帕尼培南的联合用药后的MIC差值均数为0.48，标准差为0.29，t=10.66。在帕尼培南耐药菌株中，舒巴坦联合用药后的MIC差值均数为0.52，标准差为0.41，t=8.03；帕尼培南联合用药后的MIC差值均数为0.62，标准差为0.53，t=7.33。以上t值均大于t0.01，即P

2.3联合药敏结果

棋盘法测定帕尼培南和舒巴坦联用对40株帕尼培南耐药和40株帕尼培南敏感的鲍曼不动杆菌联合药敏结果及∑FIC最大值和最小值见表4。帕尼培南和舒巴坦联用对帕尼培南敏感菌株多数表现为协同和部分协同，所占比例相加为75%， 即3/4菌株∑FIC小于1。在帕尼培南耐药菌株方面，帕尼培南和舒巴坦联用后表现为协同的菌株数比例为10.0%，表现为部分协同的菌株比例为57.5%。两类鲍曼不动杆菌对帕尼培南和舒巴坦联合均无表现为拮抗作用的菌株。

3讨论

鲍曼不动杆菌强大的环境生存能力和广泛的耐药性使其成为越来越受关注的病原菌，已超过铜绿假单胞菌成为我国ICU感染的首位致病菌。鲍曼不动杆菌具有强大的获得耐药性和克隆传播的能力，一旦对碳青霉烯类耐药，往往同时对3种以上不同类型的抗菌药物耐药，因而极易形成多重耐药菌株，对临床治疗提出了严峻挑战。2012年中国CHINET数据显示不动杆菌属对头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南和美罗培南的耐药率分别达到33%、56.8%和61.4%[6]。

国内外研究表明，多药耐药鲍曼不动杆菌的出现不仅与患者本身病情严重、治疗干预强度、自身免疫状态、基础疾病及接受侵入性操作有关，也与一定时期内某特定区域内抗菌药物的使用有关，其对抗菌药物产生耐药的速度相当迅速。

针对多重耐药、泛耐药的鲍曼不动杆菌感染，临床面对的最困难的挑战是如何选择抗菌药物进行有效治疗。从表1中可以看出，鲍曼不动杆菌一旦对碳青霉烯类抗菌药物耐药，往往意味着现有的常用广谱抗菌药物多对其无效。目前多黏菌素E、替加环素是对鲍曼不动杆菌敏感性较高的2种药物，在治疗MDRAB、XDRAB方面曾被寄予很大期望，但由于多黏菌素E存在明显的异质性耐药[7]，且肾毒性及神经系统不良反应发生率较高，临床治疗时常需联合其他抗菌药物。近年随着替加环素的临床应用，国外报道耐替加环素鲍曼不动杆菌菌株呈增加趋势，各地报道的敏感性差异大，需根据药敏结果选用[8]。接下来的几年内可能没有新型抗菌药物对革兰阴性菌有更强的活性，在新药更替缓慢的形势下，联合应用具有协同作用的现有抗菌药物是治疗多重耐药鲍曼不动杆菌感染的有效策略。《中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识》中就指出针对鲍曼不动杆菌的抗菌治疗原则为根据药敏结果选择药物联合使用，结合临床覆盖其他感染菌，并需要较大剂量和较长疗程，联合治疗方案主要选择以含舒巴坦的合剂或多黏菌素E为基础的联合[9]。

本研究选择了临床分离的帕尼培南敏感及耐药的鲍曼不动杆菌，明确帕尼培南和舒巴坦联合应用的体外抗菌活性。联合药敏棋盘法结果显示无论是帕尼培南敏感菌株还是耐药菌株，2种药物联用后各自的MIC值均明显下降，经配对t检验认为有统计学意义，因此两药联合使用对于减少用药过程中鲍曼不动杆菌耐药菌株的产生可能有一定意义。根据∑FIC结果，帕尼培南敏感菌株协同作用为30.0%（12/40），部分协同为45.0%（18/40），相加作用为15.0%（6/40），而帕尼培南耐药菌株结果显示协同作用为10.0%（4/40），部分协同为57.5%（23/40），相加作用为22.5%（9/40），两组无关作用均为10.0%（4/40），无菌株存在拮抗作用。由结果看出，无论是帕尼培南耐药还是敏感的菌株，其大多数对于帕尼培南和舒巴坦联合使用表现为协同和部分协同，值得一提的是在帕尼培南耐药及敏感菌株中两药联合均无表现为拮抗。可见在体外试验中，帕尼培南与舒巴坦联合较单药治疗可以更有效地抑制鲍曼不动杆菌的生长。

台湾一项临床研究发现在4例严重感染的菌血症患者中分离到的多重耐药鲍曼不动杆菌虽然在体外药敏实验中对碳青霉烯类抗菌药物及舒巴坦均表现耐药，但在使用碳青霉烯类抗菌药物联合舒巴坦治疗后，4例患者均获得了良好的临床结果，体外试验也证实了两种药物的联合效应，能够有效提高抗菌活性[10]。从现有的研究发现，碳青霉烯类抗菌药物联合舒巴坦对于鲍曼不动杆菌主要呈协同和部分协同作用，既往研究多选择亚胺培南或美罗培南，目前尚无帕尼培南与舒巴坦联合应用治疗鲍曼不动杆菌感染的体外试验研究。帕尼培南是最早于1994年上市的碳青霉烯类药物，其药物动力学特性与亚胺培南、美罗培南基本相似。而胃肠道反应及惊厥、意识障碍等中枢神经系统不良反应明显低于亚胺培南[11]。在一项治疗中重度肺部感染的前瞻性、多中心临床研究中，帕尼培南-倍他米隆治疗中重度肺部感染的临床有效率为84.4%，其中对鲍曼不动杆菌的清除率为50.9%[12]。韩慧等检测亚胺培南/西司他丁、美罗培南、帕尼培南、法罗培南对37株鲍曼不动杆菌的敏感性，结果显示亚胺培南/西司他丁、美罗培南耐药率均达45.9%，法罗培南为43.2%，帕尼培南最低为40.5%[13]。

舒巴坦是不可逆的、竞争型β-内酰胺酶抑制剂，通过使联合制剂中的β-内酰胺类药物避免被酶破坏而发挥抗菌作用，同时舒巴坦本身可以直接作用于细菌的青霉素结合蛋白，对鲍曼不动杆菌存在内在抗菌活性[14]，且有研究报道舒巴坦对小部分碳青霉烯类抗生素耐药的鲍曼不动杆菌菌株有效[15]。一项回顾性研究结果显示碳青霉烯类抗生素联合氨苄西林/舒巴坦以治疗多重耐药鲍曼不动杆菌引起的菌血症，其效果优于碳青霉烯类单药和碳青霉烯类联合阿米卡星[16]。舒巴坦单剂具有成本低、生产安全、容易获取等优点。与帕尼培南联合治疗鲍曼不动杆菌感染较多黏菌素、替加环素具有安全性更高、适用范围更广、临床更易获取的特点。虽然体外试验不能完全说明临床效果，但本研究结果提示舒巴坦联合帕尼培南的治疗方案，可作为治疗多重耐药鲍曼不动杆菌感染的选择之一。

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（收稿日期：2014-12-30）