3种葡萄卷叶伴随病毒RT—PCR检测

摘要 2010-2011年我们对河北省涿鹿、怀来、昌黎、宣化等县（区）以及北京市葡萄卷叶病的发生情况进行了调查，并对采集的葡萄植株样品用RT-PCR方法检测病毒种类。在检测的82个样品中，葡萄卷叶伴随病毒3号（GLRaV-3）的检出率为100.0%，葡萄卷叶伴随病毒1号（GLRaV-1）的检出率为17.1%，葡萄卷叶伴随病毒2号（GLRaV-2）的检出率为11.0%；病毒混合侵染的样品占总检测样品数的28.1%，其中葡萄卷叶伴随病毒l号、3号混合侵染样品占总检测样品数的17.1%，葡萄卷叶伴随病毒2号、3号混合侵染的样品占总检测样品数的11.0%，且在这些被病毒混合侵染的样品中，有2个样品被葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号三重侵染。

关键词 葡萄卷叶病 葡萄卷叶伴随病毒1号 葡萄卷叶伴随病毒2号 葡萄卷叶伴随病毒3号 RT-PCR

葡萄卷叶病是葡萄上发生最普遍、危害最严重的病毒病害之一。症状表现常因葡萄品种、环境条件、发病时间及年份的不同而异，一般是从葡萄植株基部叶片开始发病，叶缘向下反卷，逐渐向上部叶片发展。红色葡萄品种感病后叶肉在秋季正常变红之前变红，并随着时间的推移逐渐变为暗红色，但叶脉仍然保持绿色（图版2）；黄色品种感病后叶色不变红，但叶肉变黄或叶缘颜色变浅，叶脉有轻微褪绿。该病通常可导致葡萄减产30%～50%，使葡萄可溶性固形物含量下降28.7%，严重影响葡萄产量和品质。目前至少已发现10种葡萄卷叶伴随病毒（GLRaVs）与该病相关，其中葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号是与该病相关的3种最重要的病原物，这3种病毒均属长线形病毒科（Closteroviridae），由于其基因组为正单链RNA，且在葡萄树中病毒含量通常较低，因此逆转录一聚合酶链式反应（RT-PCR）以其灵敏度高、特异性强的特点在这3种病毒检测中应用广泛。

我国是葡萄生产大国，河北省涿鹿、怀来、昌黎、宣化等县（区）及北京市是华北地区重要的葡萄栽培基地，关于葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号在葡萄植株中的感染情况还未见报道。为此，我们采用rt-pcr方法，检测了河北省和北京市葡萄园3种主要葡萄卷叶伴随病毒的发生情况，旨在为国家管理和规范苗木生产市场、健全相关的检疫制度进行葡萄卷叶病防控提供理论依据。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1试验材料

以已知感染葡萄卷叶伴随病毒1号的1份采自辽宁的葡萄样品和感染葡萄卷叶伴随病毒2号、3号的葡萄样品作为阳性对照（保存在本实验室）。RNase抑制剂、DNA聚合酶（附带缓冲液）、DNA分子量、dNTP购自TaKaRa公司，反转录酶（附带缓冲液）购自Promega公司，RNA提取试剂盒（EASYspin plant RNA extracting kits）为博迈德公司（Biomed）的产品，琼脂糖为Sigma公司产品，其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2试验方法

1.2.1样品采集

分别于2010、2011年8-10月在北京市通州区葡萄大观园，河北省怀来县桑园镇、张家口市宣化区观后村和葡萄研究所基地、涿鹿县温泉屯乡和东小庄乡、昌黎县昌黎镇采集样品。试验共调查17个葡萄园，葡萄卷叶病发生均十分严重。试验共采集82个样品，涉及44个品种，品种包括赤霞珠、蛇龙珠、品丽珠、霞多丽、梅鹿辄、烟73等酿酒葡萄品种，红地球、无核白鸡心、美人指、白马奶、维多利亚、红光无核、龙眼等鲜食葡萄品种。其中在北京市通州区葡萄大观园采集的样品主要是鲜食葡萄品种，在河北省各县（区）采集的葡萄品种主要为酿酒葡萄品种。对每个葡萄园每个葡萄品种随机采集具卷叶症状叶片1～2份，采回的样品及时保存在-40℃冰箱中。

1.2.2检测引物

根据已发表的文献合成葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号的检测引物。引物名称、序列、退火温度及扩增片段大小如表1所示。

1.2.3总RNA提取

提取葡萄叶柄韧皮部组织（100mg）在加液氮条件下研磨成粉末，并将粉末转移到1.5mL的离心管中，然后用RNA提取试剂盒按照使用说明书进行总RNA提取。

1.2.4RT-PCR检测病毒

先将RNA反转录成cDNA，每个反应体系为20μL。先在1.5mL的离心管中加入4μL总RNA作为模板，1μL反向引物（R1、R2或R3）和5.7μLDEPC处理水，混匀，先在70℃水浴5min，后在冰上放置5min，再加入4μL5×buffer缓冲液、4μLdNTP、0.5μLRNase抑制剂（40U/μL）和0.8μLM-MLV反转录酶（200U/μL），于42℃反应1h合成cDNA。

反转录后即进行PCR扩增，在每25μL的扩增体系中，包括2μLcDNA、2.5μL10×buffer缓冲液、2μLdNTP、各0.5μL的5′和3′引物（20μmoL/L）、0.2μLDNA聚合酶（5U/μL）及17.3μLddH2O。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，退火30s（退火温度详见表1），72℃延伸30s，40个循环，最后72℃延伸10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1病毒RT-PCR检测

以已知葡萄卷叶伴随病毒1号单独侵染和葡萄卷叶伴随病毒2号、3号双重侵染的葡萄样品为阳性对照进行RT-PCR检测（图1）。为了进一步确定检测结果，我们还将葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号各3～5个RT-PCR反应原液直接送测序公司测序，然后将测序结果在NCBI上进行比对分析。分析结果表明这些扩增产物确实分别为这3种病毒的基因片段。

2.2葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号的检测结果

2.2.1不同地区葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号的检测结果

对采集的82个样品进行了RT-PCR检测，并进行统计分析，按样品采集地点的统计结果见表2。采自北京市通州区20个样品，葡萄卷叶伴随病毒3号的检出率为100.0%，有3个样品除了检测出葡萄卷叶伴随病毒3号外，还检测出葡萄卷叶伴随病毒1号；有1个样品除感染葡萄卷叶伴随病毒3号外，还检测出葡萄卷叶伴随病毒2号。采自河北省的62个样品，葡萄卷叶伴随病毒3号的检出率也是100.0%，同时有11个样品（怀来5个、涿鹿4个、昌黎和宣化各1个）还检测出葡萄卷叶伴随病毒1号（图2）；另外有8个样品（怀来4个、涿鹿3个、宣化1个）检测出葡萄卷叶伴随病毒2号，采自怀来和涿鹿赤霞珠葡萄2个样品同时检测出这3种病毒。

由上述结果可见，北京市、河北省葡萄园中普遍感染了葡萄卷叶伴随病毒3号，葡萄卷叶伴随病毒1号、2号均没有单独侵染葡萄植株，而是与葡萄卷叶伴随病毒3号混合侵染。其中葡萄卷叶伴随病毒1号和葡萄卷叶伴随病毒3号混合侵染率为17.1%，葡萄卷叶伴随病毒2号和葡萄卷叶伴随病毒3号的混合侵染率11.0%，这些样品中还有2个样品被这3种病毒三重侵染。

2.2.2不同葡萄品种葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号的检测结果

对采集的所有葡萄品种中均检测出葡萄卷叶伴随病毒3号，这表明我国北京、河北等地的葡萄品种上可能均有该病毒侵染。对部分酿酒和鲜食葡萄品种葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号的检测结果如表3所示。结果表明，赤霞珠、蛇龙珠被葡萄卷叶伴随病毒二重侵染率很高，分别为50.0%和32.5%，同时赤霞珠有20.0%的样品被葡萄卷叶伴随病毒1号、2号和3号三重侵染。

3 小结与讨论

河北、北京葡萄园中3种葡萄卷叶伴随病毒RT-PCR检测结果表明，葡萄卷叶伴随病毒3号的检出率最高，达100.0%，这表明在我国河北、北京检测葡萄园中葡萄卷叶伴随病毒3号是与葡萄卷叶病相关的最重要的病原物，这与来自世界其他葡萄栽培地区如加拿大、美国、伊朗、土耳其的报道一致。但是河北、北京地区葡萄园的葡萄卷叶伴随病毒3号的感染率要大大高于别的国家，而且该病毒在所检测的葡萄品种中普遍发生。同时调查结果也显示，作为我国第一大酿酒葡萄栽培品种赤霞珠，其二重侵染率达到50.0%，这些结果均表明我国河北、北京地区葡萄生产中受到葡萄卷叶伴随病毒的影响可能更严重。

葡萄卷叶伴随病毒主要通过带毒苗木、无性繁殖材料的调运和与带毒砧木嫁接进行传播。调查中发现，缺乏有效监控的葡萄苗木调运是导致葡萄卷叶伴随病毒感染率高的重要原因。因此我们下一步的工作是获得全国葡萄栽培基地中3种主要葡萄卷叶伴随病毒感染情况的详细数据，为国家管理和规范苗木生产市场、健全相关的检疫制度提供理论参考。