香菇液体培养过程中3种胞外酶酶活的变化

摘要：研究了香菇[Lentinus edodes （Berk.） sing]808在液体培养时淀粉酶、羧甲基纤维素酶（CMC酶）、漆酶3种胞外酶酶活的变化，以及胞外蛋白质含量的变化。结果表明，淀粉酶酶活在培养第4天时出现高峰，CMC酶、漆酶酶活都在第13天达到最高值，说明香菇最先利用的物质是淀粉。胞外蛋白质含量的变化与总酶酶活变化基本相同。

关键词：香菇[Lentinus edodes （Berk.） sing]；淀粉酶；羧甲基纤维素酶；漆酶

中图分类号：S646.1+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）14-3391-03

香菇[Lentinus edodes （Berk.） Sing.]隶属于伞菌目，营养丰富，具有一定的药用价值[1]，且适应性强、栽培面积广。香菇生物降解木质纤维素及其他有机大分子是通过基质中的菌丝不断向胞外分泌各种酶来实现的，因此酶活的大小直接影响生物降解能力[2]，与香菇的产量密切相关。近年来有关香菇的品种选育、栽培及液体培养已有报道，但是尚未有香菇在液体培养条件下3种胞外酶酶活的研究报道。本研究重点探讨香菇液体培养时胞外酶的酶活，为营养生理研究以及香菇的高产栽培提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供测菌种 808品种为浙江省主栽香菇品种。

1.1.2 培养基 PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，用去离子水补足至1 000 mL，pH自然，于121 ℃灭菌20 min。液体培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、MgSO4 1 g、KH2PO4 1 g、维生素B 0.02 g，pH自然，用去离子水定容至100 mL（用250 mL锥形瓶），于121 ℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌种的活化 菌种活化以PDA培养基为基础培养基，在无菌条件下，用接种针从香菇菌种上切取1 cm2的菌块至活化培养基上[3]，于25 ℃培养箱中黑暗培养7～12 d，直至菌丝长满斜面，确定无污染且长势良好后作为供试菌种。

1.2.2 种子液的制备 向液体培养基中接入供试菌种，每支斜面试管接一瓶[4]，3次重复，封口标记后置于（25±1） ℃恒温摇床中，以100 r/min振荡培养8～12 d，即得种子液。

1.2.3 液体培养 将种子液的菌丝球匀浆后接入培养基中，按接种量10%接种至液体培养基中[5]，置于（25±1） ℃恒温摇床中以100 r/min振荡培养。

1.2.4 粗酶液的制备 定时观察，从第4天开始，每隔3 d吸取发酵液5 mL，于4 ℃下以4 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液，连续测定6次，最后一次制备酶液与前一次相隔2 d。

1.2.5 淀粉酶酶活的测定 取10 g/L可溶性淀粉溶液（用pH 4.6，0.1 mol/L醋酸缓冲液配制）1.2 mL、粗酶液0.8 mL，于40 ℃水浴中保温30 min，取出后立即加入2 mL DNS试剂，于沸水中显色10 min。冷却后加入去离子水定容，混匀，于520 nm[6]处测吸光度，以在沸水浴中煮沸灭活15 min的酶液为对照，设置3个平行，取平均值。1个酶活单位（1 U）定义为1 mL的发酵液在40 ℃下1 min生成0.1 mg还原糖的淀粉酶的量[7]。DNS试剂具体制备方法参照文献[5]。

1.2.6 羧甲基纤维素酶（CMC酶）酶活的测定 取5 g/L CMC-Na溶液（用pH 4.6，0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液配制）[5，8，9]1 mL、粗酶液1 mL，于50 ℃水浴中准确保温30 min，之后的操作方法与1.2.5同。

1.2.7 漆酶酶活的测定 采用ABTS法，具体参考文献[10，11]。3 mL酶活反应体系含1 nmol/L ABTS 0.5 mL、酶液0.5 mL和HOAc-NaOAc（pH 4.5）缓冲液2.0 mL。在反应的前3 min内在420 nm处测定吸光度的变化（每15 s记录一次）。以1 nmol/L ABTS 0.5 mL、HOAc-NaOAc（pH 4.5）缓冲液2.5 mL的混合液作为对照。

1.2.8 蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝染色测定法[12]。具体操作如下：取去离子水0.9 mL、粗酶液0.1 mL、考马斯亮蓝染色液5 mL至试管中，混合均匀，于595 nm处测吸光度，以去离子水1 mL、考马斯亮蓝5 mL的混合液作为对照，设置3个平行试验，取平均值。作牛血清白蛋白标准曲线，得出蛋白质含量。

2 结果与分析

2.1 香菇液体培养过程中淀粉酶、CMC酶、漆酶酶活的变化

由图1A可知，淀粉酶酶活在培养的第4天达到最高值28.33 U。随后，淀粉酶酶活逐渐降低，直到降至第10天的3.94 U，在第13天，又出现一个小高峰。这表明香菇液体培养时最先利用的是淀粉。分析原因可能是在生长初期，菌丝生长需要大量的营养物质，而培养基中含有的大量淀粉成为最直接的营养源，这时淀粉酶发挥主要作用，酶活高；接下来酶活逐渐降低可能是因为菌丝体生长消耗了大量的营养物质淀粉，从而阻碍了淀粉酶的酶活。

CMC酶酶活对食用菌增产潜力有重要影响作用[13]。由图1B可知，CMC酶在培养前期酶活较低，在第7天达到第一个小高峰，为17.56 U，随后酶活稍有下降，但从第10天开始又迅速增加，并在第13天出现最高值，高达41.21 U，说明香菇菌丝体利用纤维素较淀粉晚。

由图1C可知，漆酶在培养前期酶活处于低水平，且增长极其缓慢，直到第10天才开始迅速增长，并且在第13天达到最大值15.69 U，随后几天迅速降低。漆酶的产量与木质素降解率呈正相关关系[14]，它能加速木质素芳香族高分子化合物的分解，为菌丝提供丰富营养；菌丝生长速度越快，分泌的漆酶也就越多，酶的代谢产物醌的含量也就增加了，这可以增强菌种的抗病能力，抑制杂菌的污染[15]。

2.2 香菇液体培养过程中胞外蛋白质含量的变化

粗酶液中的蛋白质主要是各种胞外降解酶，包括试验中测定的淀粉酶、CMC酶、漆酶以及其他未测定的酶类，比如半纤维素酶等，此时蛋白质含量的变化在一定程度上可以反应总酶酶活的变化。由图2可知，在液体培养期间胞外蛋白质含量变化较大，从第4天开始蛋白质含量迅速增加，在第7天时出现峰值0.058 5 mg/mL，然后含量有所下降，在第13天再次出现一个峰值0.049 0 mg/mL，与第一个峰值相比较小，然后又迅速下降至0.019 5 mg/mL，并在试验结束前期有小幅度增加。综合以上3种酶酶活的变化可知，胞外蛋白质含量的变化与总酶酶活的变化基本一致。

3 讨论

淀粉酶、CMC酶为多糖降解酶，漆酶是与木质素降解有关的酚氧化酶[12]。由试验结果可知，在整个试验期，3种胞外酶均有酶活，CMC酶和漆酶酶活同在第13天达到高峰值，而淀粉酶酶活则在第4天出现高峰值，胞外蛋白质含量的变化也在一定程度上反映了总酶酶活的变化。

从淀粉酶活性变化曲线可知，对淀粉酶的测定应该要提早几天，这样可以得出更完整的变化曲线；在培养中期酶活出现一个小高峰，这与陈国梁等[13]对羊肚菌进行液体培养时测定的淀粉酶酶活变化相同，原因需进一步研究。胞外蛋白质含量的变化与总酶酶活的变化基本相同，但是，蛋白质含量的变化与各个酶的相关性则尚未研究清楚，需在今后的试验研究中探明。

倪新江[2]提出香菇胞外酶酶活的大小直接影响生物降解的能力，与香菇的产量有密切关系，因此，研究提高胞外酶酶活的方法，如研究植物生长调节剂、培养温度与湿度等对胞外酶的影响，对香菇产量的提高有着重要意义。

参考文献：

[l] 刘春如，易 诚.香菇的营养价值和药用价值[J].中国林副特产，2002（1）：52-53.

[2] 倪新江.香菇生长过程中几种胞外酶活性的变化规律[J].食用菌学报，1995，2（4）：22-27.

[3] 秦秀丽. 香菇菌种液体培养基的优化[J]. 特产研究，2008（4）：49-53.

[4] 宋爱荣，郭立忠，刘作亭，等.七个白色金针菇菌株发酵液中四种胞外酶活性的测定与分析[J].中国食用菌，1999，18（4）：31-34.

[5] 曹春蕾，崔宝凯，秦问敏. 桑木层孔菌液体培养过程中几种胞外酶活性的变化[J].菌物学报，2001，30（2）：275-280.

[6] 王俊丽，聂国兴，李素贞，等. DNS法测定还原糖含量时最适波长的确定[J].河南农业科学，2010（4）：115-118.

[7] 曾东方，杨 帆，聂欢欢. DNS法对食用菌发酵液淀粉酶活力的测定[J].现代农业科技，2011（11）：16-18.

[8] 朱启忠.侧耳792几种胞外酶活性的测定比较[J].食用菌，2006（5）：7-8.

[9] 王宜磊. 金针菇液体培养特性及胞外酶研究[J].微生物学杂志，2002，22（1）：34-35.

[10] 林俊芳，刘志明，陈晓阳，等.真菌漆酶的酶活测定方法评价[J].生物加工过程，2009，7（4）：1-8.

[11] 莫佳琳，付时雨，詹怀宇，等.白腐菌液体培养产生漆酶的研究[J].纤维素科学与技术，2008，16（1）：13-19.

[12] 谢丽源，邓科君，张 勇.桑黄深层发酵胞外酶活性的测定与分析[J].食品工业科技，2010，31（7）：183-186.

[13] 陈国梁，张向前，贺晓龙，等.五种羊肚菌液体培养过程胞外酶活性变化研究[J].北方园艺，2010（10）：210-213.

[14] 王海磊，郭伟云，于广丽，等.金针菇降解木质素的能力及相关酶活研究[J]. 河南师范大学学报（自然科学版），2004，32（4）：96-99.

[15] 郭立忠，郭 华，李维峰，等.七个巴西蘑菇菌株胞外酶活性的测定与分析[J].莱阳农学院学报，2002，19（3）：210-212.