二烯丙基二硫对人白血病HL-60细胞株survivin表达的影响

【摘要】目的：观察二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）作用于人白血病hl-60细胞株后，细胞增殖及survivin蛋白表达的变化，探讨DADS对HL-60细胞增殖的影响及其机制。 方法：DADS作用HL-60后，MTT法检测细胞增殖情况，SP-免疫组化法检测细胞survivin蛋白表达的变化。 结果：DADS可以呈时间－浓度依赖性抑制HL-60细胞增殖并下调survivin蛋白的表达。 结论：DADS能通过下调survivin蛋白的表达而抑制HL-60细胞的增殖。

【关键词】二烯丙基二硫；HL-60细胞株；Survivin

文章编号：1009-5519（2007）21-3166-02 中图分类号：R73 文献标识码：A

Effect of diallyl disulfide on the expression of survivin protein in human leukemia HL-60 cell line

YU Ming-xia，FAN Zi-li，YAO Chen-jiao

(Department of Hematology，The Third Affiliated Hospital of Xiangya Medical College，Central South University，Changsha 410013，China)

【Abstract】Objective：To study the proliferation and expression ofsurvivin protein in human leukemia HL-60 cell line treated with diallyl disulfide (DADS) and to thus investigate the mechanism of DADS to inhibit HL-60 cells' growth.Methods：MTT was used to test the growth of HL-60 cells treated by DADS；while SP-immunohistochemistry for the expression of survivin protein in HL-60 cells.Results：DADS could inhibit the proliferation and down-regulate the expression of survivin protein of HL-60 cell line in a dose-time dependent manner.Conclusion：DADS can effectively inhibit the proliferation of HL-60 cell line by down-regulating the level of survivin protein.

【Key words】Diallyl disulfide；HL-60 cell line；Survivin

二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）是一种小分子量的大蒜脂溶性提取物，有研究表明，DADS可以抑制白血病、乳腺癌、皮肤癌、肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、结肠癌等肿瘤细胞的生长[1]。本试验选用人急性髓系白血病HL-60细胞株为研究对象，观察DADS作用后细胞增殖及survivin蛋白表达的变化，以探讨DADS对HL-60细胞增殖的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 试剂：1640培养基为美国GIBCO 公司产品，小牛血清为杭州四季青生物工程公司产品。四甲基偶氮唑盐（MTT）为北京夏新生物有限公司产品，SP－免疫组化染色试剂盒为北京中衫金桥生物技术有限公司，兔抗人survivin IgG多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，DADS为美国Fluka 公司产品，按说明书用二甲基亚枫（DMSO）溶解配制，DMSO终浓度

1.2 细胞系：人急性髓系白血病HL-60细胞株由中南大学湘雅医学院细胞中心提供。细胞生长于含10％的灭活新生小牛血清的RPMI1640完全培养基中，置于37 ℃、5%二氧化碳（CO2）饱和湿度的培养箱中培养。细胞经传代和收集，取对数生长期细胞进行实验。

1.3 MTT比色实验测定细胞增殖：实验分为8组。1～6 组为不同浓度(0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 mg/L)DADS；7组为空白对照(RPMI 1640)；8组为溶媒DMSO对照组(终浓度为0.01％)；每组8个复孔。细胞传代并接种于96孔塑料培养板中，给予上述处理因素，置37 ℃，5 % CO2培养箱中分别培养24、48和72小时。每孔加入5 mg/ml的MTT 溶液，继续培养4小时后离心，弃上清，每孔加入200 ?滋l的无水乙醇，振荡摇匀，使结晶物充分溶解，测波长490 nm吸光度(A) 值。按下面公式计算各浓度组的抑制率。细胞生长抑制率(%) =(1-A实验组/A对照组)×100%。

1.4 SP－免疫组化法检测细胞内survivin蛋白：试验分5组，1～3组为不同浓度（5、10、20 mg/L）DADS；4组为空白对照(RPMI 1640)组；5组为溶媒DMSO对照(终浓度为0.01％)。分别培养24、48、72小时后，收集各时相细胞，应用过氧化物酶－链霉卵白素（SP）免疫组化方法，按照试剂盒说明书操作，DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。细胞染色强度指数（staining intensity index，SII）的计算：油镜下随机计数500个细胞，计数其中survivin染色阳性的细胞数。染色强度分为四级：不着色为阴性，淡黄色、呈云雾状为弱阳性，黄色为阳性，黄褐色为强阳性。计数每一度强的细胞数目，计算染色强度指数SII=(阴性细胞数×0)＋（弱阳性细胞数×1）＋（阳性细胞数×2）＋（强阳性细胞数×3）[2]。

1.5 统计学处理：所有数据均以均数±标准差(x±s)表示。采用SPSS 10.0计算机软件对所得数据进行分析，两样本间比较用配对t检验，多组样本均数间比较用单因素方差分析，双因素相关分析，两两之间多重比较：方差齐用LSD检验、方差不齐用Dunnett T3检验。P

2 结果

2.1 MTT法显示DADS对HL-60细胞增殖的影响：DADS浓度为0.625 mg/L时即对HL-60细胞的增殖产生抑制作用，随浓度增加，时间延长，抑制作用增强，见图1。

2.2 SP-免疫组化法显示DADS对HL-60 细胞survivin蛋白表达的影响：survivin蛋白在未经DADS干预的HL-60细胞胞质，胞核内均有表达。见表1、图2。5、10、20 mg/L的DADS作用HL-60细胞24、48和72小时后呈浓度－时间依赖性抑制HL－60细胞survivin蛋白的表达。

3 讨论

近年来发现，大蒜有效脂溶性成分DADS能抑制多种肿瘤细胞的生长，并且可以诱导部分肿瘤细胞凋亡、分化、周期阻滞，抑制肿瘤血管形成[3]。我们用0.625～20 mg/L的DADS作用于HL-60细胞24、48、72小时， MTT结果显示： DADS可呈时间－浓度依赖性抑制HL-60细胞的增殖，这一结果与武明花等[4]的结果相同，进一步证实了DADS对白血病细胞生长确有负调控作用。

Survivin是新近发现的一种属IAP（inhibitor of apoptosis protein）家族的细胞凋亡抑制蛋白[5]，普遍表达于大部分的人类肿瘤细胞，除生殖腺和胸腺外，不表达于已分化细胞[6]。survivin是目前发现的最强的凋亡抑制因子，它可以直接抑制凋亡终末效应蛋白Caspase-3和Cspase-7活性，阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程，尚参与细胞周期的调控。在有丝分裂过程中，抑制caspase-3对微管结构蛋白的水解，维持微管蛋白和纺锤体的稳定性而使细胞有丝分裂顺利进行[7]。这一特性与survivin表达的G2/M期依赖性一致，Survivin的表达与细胞耐药及白血病预后密切相关。耐阿霉素的K562/ADM、耐多柔比星的K562、多药耐药的HL-60R等，均较其母系细胞株表达更高水平的survivin[8]。survivin表达阳性的白血病患者，对常规化疗不敏感，骨髓缓解率低，且多于早期复发，生存率小于阴性患者，提示survivin表达是影响白血病预后的不利因素[9]。因此，抑制survivin的表达有可能诱导肿瘤细胞凋亡、阻碍细胞有丝分裂正常进行而发挥抗肿瘤作用。鉴于survivin在恶性肿瘤中的重要作用，本试验用免疫组化法检测DADS是否可以下调survivin蛋白的表达。实验发现，HL-60细胞株高度表达survivin蛋白，且胞浆、胞核内均有表达。5、10、20 mg/L的DADS分别干预HL-60细胞24、48及72小时后，survivin蛋白表达明显受抑制，并呈浓度－时间依赖性。我们推测，DADS抗肿瘤机制之一，是通过抑制survivin蛋白的表达，使细胞不能顺利完成有丝分裂，并可能触发后续的凋亡。

本研究仅对体外抗HL-60细胞增殖抑制进行探讨，其体内抗肿瘤活性如何，对其他类型白血病是否有效，更是值得深入探讨的问题。

参考文献：

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[4] 武明花，唐 黎，李利平，等．二烯丙基二硫对HL-60 细胞的生长抑制和诱导分化作用[J]. 中华血液学杂志，2004，25（5）：300.

[5] Altieri DC．Validating survivin as a cancer therapeutic target[J]．N at Rev Cancer，2003，3 (1)：46.

[6] Veiculeseu VE，Madden SL，Zhang AE，et al．Analysis of human tran-scriptomes[J]．Nature Genetics，1999，23：387.

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[8] Moriai R，Asanuma K，Kobayashi D，et al．Quantitative analysis of the anti-apoptotic gene survivin expression in m alignant haematopoietic cells[J]．Anticancer Res，2001，21：595.

[9] Adida C，Recher C，Raffoux E．et al. Expression and prognostic sig-nificance of survivin in de novoacutemyeloidleukaemia[J].Br J Haematol，2000，l11：196.

收稿日期：2007-07-19