花生蛋白激酶基因AhSTK的克隆与序列分析

摘要：从优质花生鲁花14的cDNA文库中发现一条序列，全长为1 399 bp，3′端含有polyA尾，通过blastx搜索得知其为蛋白激酶基因，命名为AhSTK。以该花生cDNA序列为模板设计引物，克隆得到花生AhSTK基因。序列分析表明，AhSTK基因的开放阅读框长度为1 080 bp，编码359个氨基酸，预测其分子量为389 kD，等电点为642，编码的蛋白质无信号肽，无跨膜结构，预测定位于细胞质。与其他植物中蛋白激酶的氨基酸序列比对发现，与大豆GmSTK蛋白同源性最高。器官特异性分析发现，该基因在花生根中表达量较高，而在花中表达量较低。花生AhSTK基因的克隆为进一步研究其生物学功能和应用奠定了基础。

关键词：花生；蛋白激酶；AhSTK蛋白；序列分析；器官特异性表达

中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0009-05

蛋白激酶是一类磷酸转移酶，在真核生物中其作用是将ATP的γ磷酸基团转移到底物特定的氨基酸残基上，使蛋白质磷酸化。目前在很多植物中发现并分离出了蛋白激酶，如拟南芥[1]、玉米[2]、小麦[3]、豌豆[4]、烟草[5]、紫花苜蓿[6]、大豆[7]、番茄[8]、水稻[9]等，这些蛋白激酶的磷酸化过程被证实参与植物中的许多信号途径，包括抵抗高盐、干旱和低温等恶劣条件的反应，调节植物组织、器官的正常发育，保持植物正常生理功能，参与激素信号传递等。

Stone和Walker根据蛋白激酶催化区域氨基酸序列的相似性，将植物蛋白激酶分为5大组，分别为①AGC组：以cAMP（环腺苷酸）依赖的蛋白激酶PKA、cGMP（环鸟苷酸）依赖的蛋白酶PKG及钙和磷脂依赖的蛋白激酶PKC为代表，以受第二信使（如cAMP、cGMP、DAG和Ca2+）激活为特征；②CaMK组：包括Ca2+/CaM依赖的蛋白激酶CaMK、Ca2+依赖而CaM不依赖的蛋白激酶CDPK等，依赖第二信使是该组蛋白激酶的普遍性；③CMGC组：包括MAPK（分裂原激活的蛋白激酶）、CDK（周期素依赖的蛋白激酶）等，相对于前2组蛋白激酶依赖于第二信使，该组激酶作用于下游的磷酸化级联系统；④传统的PTK组：为酪氨酸蛋白激酶，目前在植物中尚未发现纯粹的酪氨酸蛋白激酶，但并不意味着Tyr残基的磷酸化对植物不重要。二重特异性蛋白激酶如MAPKK在植物中的发现，证明了Tyr残基的磷酸化可能在高等植物中具有重要的生理作用；⑤其它组：如类受体蛋白激酶RLKs及乙烯信号转导元件CTRl（胞质级联蛋白激酶MAPKKK）等[10]。一般由蛋白激酶催化的磷酸化反应中接受磷酸基的部位是丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的羟基。蛋白激酶在信号转导中主要有两个方面的作用：一是通过磷酸化调节蛋白质活性，磷酸化和去磷酸化是大多数信号通路组分可逆激活的共同机制，一些蛋白质磷酸化后具有活性，一些则去磷酸化后具有活性；二是通过蛋白质的逐级磷酸化，使信号逐级放大，引起细胞反应[11]。

对植物蛋白激酶的研究开始较晚，主要集中在对受体蛋白激酶的研究上，其他类蛋白激酶的研究还处于初级阶段。随着在越来越多植物中发现蛋白激酶，它在植物生长发育、抗逆性、激素及钙信号传导等的作用研究也越来越深入。这为了解植物生长发育及抗逆性机制，改良植物尤其是农作物表观性状或抗逆性等方面提供了必要的条件[12]。

花生是我国重要的油料和经济作物之一，种植面积约5025×104 hm2，总产量居世界首位[13]。花生在其生长过程中经常会遭受不同的生物和非生物胁迫，严重影响植物的生长发育，并对农业生产造成极大的负面影响[14]。通过对花生AhSTK基因及其编码蛋白的分析与研究，可以了解其参与的信号途径及其生理功能，为增强花生抗逆性、调节花生生长发育及提高花生产量提供一定的理论基础。

本试验从优质花生鲁花14 cDNA文库中获得了AhSTK基因， 利用PCR方法获得AhSTK基因目的片段，对其进行生物信息学分析，为今后的转基因工作奠定基础。1材料与方法

11试验材料

111植物材料试验材料为优质花生品种鲁花14，种植于山东省农业科学院实验农场。

112试验试剂RNA 的CTAB 提取液由本实验室配制，参照《分子克隆实验指南》（Sambrook and Russell， 2002）；DNA回收试剂盒（TIANGEN），反转录试剂盒（Fermentas），rTaq酶（Takara），T4 DNA Ligase（Takara），其他常规化学试剂均为国产分析纯。

113载体及菌株T3克隆载体、大肠杆菌（Escherichia coil）DH5α均购于全式金。

114引物的合成目的基因的克隆引物和花生内参基因Actin的克隆引物（上海生工公司合成）。

12试验方法

121AhSTK基因序列的获得通过对花生EST序列（EG0288151、ES7036391、ES7037731、ES7229771、GO3267121、GO3322971）进行电子拼接得到AhSTK基因序列。

122花生总RNA的提取、纯化及反转录取适量花生根、茎、叶、幼嫩种子、花加入液氮研磨，用CTAB法提取总RNA。按照Fermentas公司的反转录试剂盒操作步骤进行反转录，得到完整的cDNA。所有cDNA样品均保存于-20℃冰箱中备用。

123目的基因的获得与克隆以该序列为模板，利用上游引物AhSTK-S和下游引物AhSTK-A克隆该基因。 PCR扩增反应程序为： 94℃预变性5 min；94℃变性30 s， 55℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，35个循环；72℃终延伸10 min。PCR产物用10%琼脂糖凝胶电泳检测。将与目的基因大小一致的PCR产物回收，回收的目的片段连入T3克隆载体测序。

124质粒的提取、DN段的回收 分别采用TIANGEN公司的普通质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行。

125目的基因序列分析目的基因序列采用NCBI数据库ORF Finder（http：//wwwncbinlm

nihgov/gorf/gorfhtml） 在线分析获得开放阅读框，使用Primer50翻译获得氨基酸序列，登陆网站http：//webexpasyorg/protparam/推测目的蛋白的分子质量和等电点，信号肽、跨膜区的预测分别通过网站http：//wwwcbsdtudk/services/SignalP/ 和http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM/获得，从http：//wwwncbinlmnihgov/Structure/cdd/wrpsbcgi网站获得AhSTK蛋白的保守结构域，亚细胞定位预测分析在http：//wwwbioinfotsinghuaeducn/SubLoc/上进行。将预测的AhSTK蛋白序列与GenBank中其他植物的AhSTK蛋白通过DNAMAN进行序列比对，构建系统进化树。

126器官特异性表达分析内参基因Actin的扩增：以反转录产物cDNA为模板，利用上游引物Actin-S和下游引物Actin-A克隆Actin基因。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸40 s，28个循环；72℃终延伸10 min。PCR产物用15%琼脂糖凝胶电泳检测。通过调整各模板量，使不同样品扩增的Actin的量一致。

AhSTK基因的扩增：以摸索好的cDNA模板量和循环数、最佳扩增条件来扩增单一的目的条带。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min 40 s，32个循环；72℃终延伸10 min。PCR产物用10%琼脂糖凝胶电泳检测。

2结果与分析

21AhSTK基因序列的克隆

在对花生cDNA文库进行大规模测序获得的序列中，我们发现一条编码一种蛋白激酶的序列。在NCBI中进行Blast比对，找到6条同源性较高的EST序列（EG0288151、ES7036391、ES7037731、ES7229771、GO3267121、GO3322971）。通过电子拼接，可以把这7条EST序列拼接为一条具有完整读码框的花生蛋白激酶基因序列。该序列全长1 399 bp，5′UTR 为52 bp，3′UTR为267 bp，读码框1 080 bp（图1）。

22AhSTK基因序列分析

通过NCBI中的ORF Finder分析知，AhSTK基因具有完整的开放阅读框（ORF），在扩增片段的36 bp处有起始密码子ATG，在1 113 bp处有终止密码子TAA（见图1），因此该基因编码的蛋白质有359个氨基酸，其相对分子量约为389 kD，等电点为642。

通过NCBI软件分析该蛋白的保守结构域，发现从70到265氨基酸之间含有以cAMP（环腺苷酸）依赖的蛋白激酶PKA的保守催化结构域（图3），催化ATP的γ磷酸基团转移到底物特定的丝氨酸/苏氨酸或酪氨酸的羟基上，使蛋白质磷酸化，引起下一个激酶的反应，以此使信号从细胞表面传递到靶蛋白，引起细胞反应。

根据http：//prositeexpasyorg/分析保守结构域，67到347氨基酸之间是蛋白激酶的结构域，从81处的缬氨酸到96处的赖氨酸之间是ATP结合域，193处的异亮氨酸到205处的异亮氨酸之间是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性域。

根据以上分析推测，AhSTK基因编码的蛋白催化ATP的γ磷酸基团转移到底物特定的丝氨酸/苏氨酸羟基上，属于PKA。如多数蛋白激酶一样，此类蛋白激酶自身受到严格的调节，当cAMP不存在时呈非活性形式，与其它蛋白激酶不同的是，活化配体cAMP结合到特异的调节亚基（R）上引起构型的改变从而导致全酶的解离，经活化而解离的催化亚基（C）和所有真核生物的蛋白激酶有着广泛相似的结构序列。

23AhSTK蛋白的信号肽与亚细胞定位分析

经过SignalP40软件分析，发现AhSTK蛋白没有信号肽；用TMHMM20分析得知，该蛋白不含跨膜结构域；亚细胞定位分析显示该蛋白位于细胞质。

24AhSTK蛋白的系统进化树分析

利用DNAMAN软件将该基因氨基酸序列与其他六种植物氨基酸序列进行比对，发现有很高的同源性，其中与大豆中的GmSTK蛋白同源性最高，其次是苜蓿（图4）。

25AhSTK的器官特异性表达分析

我们进一步分析了AhSTK基因在花生不同器官的表达情况，结果（图5）表明，AhSTK基因在根中表达量最高，在幼嫩种子中次之，花中表达量最低。

本研究从花生中克隆并鉴定了AhSTK基因。用NCBI中的ORF Finder找出该基因具有完整的开放ORF，编码359个氨基酸，从70到265氨基酸之间含有蛋白激酶保守的催化结构域，从81处的缬氨酸到96处的赖氨酸之间是ATP结合域，193处的异亮氨酸到205处的异亮氨酸之间是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性域，属于cAMP（环腺苷酸）依赖的蛋白激酶PKA。同源性比对发现与其他植物中的蛋白激酶有很高的同源性，挑选相似性较高的序列进行多序列比对，发现这些蛋白在蛋白激酶保守结构域处序列非常相似；系统进化分析得知花生AhSTK蛋白与大豆GmSTK亲缘关系较近，其次是苜蓿。亚细胞定位预测显示其定位在细胞质；半定量分析得出其在根中表达量最高。这类蛋白在植物中调节离子通道活性的功能研究得较清楚，但其参与调节基因的表达及响应外界高盐、干旱等刺激还有待进一步研究。本实验只对花生中AhSTK基因及其蛋白序列做了克隆与分析，对其功能的研究还需进一步探索。参考文献：

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