细胞周期蛋白激酶抑制剂研究现状

[摘要] 目前普遍观点认为，肿瘤产生的本质是细胞增殖的调节失控，而细胞的增殖要通过细胞周期来调控。细胞周期调控激酶复合物[cyclin dependent kinase（CDK）/Cyclin]活性的异常是导致细胞周期失控的根本原因。抑制CDK/Cyclin激酶的活性成为有效治疗肿瘤的策略之一。因此，针对CDK/Cyclin激酶抑制剂的研究是当前抗肿瘤药物开发的热点之一。本文对近年来CDK/cyclin抑制剂的种类及目前其在临床应用中出现的问题进行概述。

[关键词] 细胞周期蛋白激酶抑制剂；肿瘤；细胞周期

[中图分类号] R979.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）13-44-04

[Abstract] As normally accepted， the cell proliferation is regulated through cell cycle and the occurrence of tumor may lie in deregulation of cell cycle， directly resulted from the abnormal of the complex of cyclin dependent kinase（CDK）.It has become one of the most effective strategies to inhibit the activity of the complex for dealing with tumors.Thus，the study on CDK/Cylclin complex inhibitors is one of hot focuses in antitumor drug discovery.This thesis mainly discusses the types of CDK/Cyclin inhibitors and their clinical issues.

[Key words] Inhibitor；Cancer；Cell cycle

细胞周期的调控过程是在检查点的监视下，各种调控因子依次激活或灭活，从而启动细胞完成DNA复制，分裂为2个子代细胞的过程。在诸多细胞周期调控因子中，细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）是处于核心位置，其与细胞周期蛋白Cyclins、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKIs）等组成细胞周期调控的网络系统[1]。CDKs是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，目前有13种包括CDK1～13，分别在细胞周期调控CDKs（1～6）和转录调控CDKs（7～13）起作用。细胞周期的调控事实上就是检查点的调控，其中以G1/S调控点最为重要。细胞周期受到外界信号如生长因子等刺激时，催化亚基CDK4/CDK6与调节亚基CyclinD结合后，CDKs残基被磷酸化/去磷酸化修饰而被激活，CDKs激活后催化Rb蛋白使之磷酸化，Rb基因（retinob lastoma gene）又称为视网膜母细胞瘤基因，是第一个被克隆的抑癌基因，其蛋白磷酸化后与转录因子（如E2F）形成复合物的能力丧失，E2F在细胞周期调控中起重要作用，能诱导CyclinE和CDK2的表达并形成CyclinE/CDK2复合体，后者进一步使Rb蛋白磷酸化，充分释放E2F，随后E2F进入核内激活一系列细胞周期进入S期的必须基因的表达。在S期内DNA复制晚期，CDK2被cyclinA激活，使转录因子E2F及时失活，阻止了由持续激活的E2F导致的细胞凋亡[2-3]。

1 CDK/Cyclin抑制剂的种类

研究统计显示，有超过90%的人类癌症中CDK、Cyclin、CKI和Rb途径中相关基因发生了变异，其中CDK和其相应的调节亚基Cyclin的失常最为频繁[2-3]。此外，细胞周期的波动促进了化疗的抗性，降低了化疗的效果。因此恢复细胞周期正常的CDK/Cyclin活性调控是治疗肿瘤的策略之一。药物研究人员已经把寻找不同类型CDK和Cyclin抑制剂作为前沿的抗肿瘤药物的重点研究方向。目前CDK抑制剂主要有内源性的和外源性的两种。

1.1 内源性小分子抑制剂

1.1.1 小分子量蛋白 内源性小分子抑制剂中最大的一类是低分子量蛋白质，根据结构功能的差异分为两大类：一类称双重特异家族INK4，包括p15，p16，p18，p19，该蛋白家族可抑制cyclin D相关激酶的活性，其抑制作用依赖蛋白与相应的游离CDK4结合，从而阻断CDK4与相应cyclin D结合形成具有催化功能的二聚体复合物。另一类叫Kip家族，包括p21，p27，p57，该蛋白家族可以和cyclin E/CDK2与cyclinA/CDK1组成的二聚体复合物再组成三聚体，通过封闭二聚体的催化活性中心从而发挥其抑制作用这些内源性抑制因子与激酶复合物结合后，可特异性地调节其活性，从而精确调节细胞由G1期向S期的转化过程，内源性CDK调节剂的存在不仅提示细胞本身的分裂、增殖具有精密的调控机制，而且也反应了该信号转导系统在细胞周期调控中的重要作用与地位[1-5]。研究表明，多种肿瘤的发生、发展过程与CDKs/cyclins的过度表达或其内源性抑制因子表达下降有关，如p16的缺失与小细胞和黑色素瘤、肺癌、乳腺癌和结直肠癌的发生密切联系[4-7]；p27蛋白的缺失常见于乳癌，前列腺癌，结肠癌以及消化道肿瘤[8-12]。因此，内源性CDKs抑制因子的缺失或基因突变是肿瘤诊断的重要参考指标。

1.1.2 非编码小RNA 内源性小分子抑制剂还有一类是近年来发现的一类重要的非编码RNA――microRNA，MicroRNA是一种长度在21～23nt的非编码RNA，通过与靶基因mRNA 3’UTR区的靶位点区域相互结合而快速有效地降解mRNA或抑制蛋白的翻译，将蛋白控制在生命活动所需的较低或最佳的水平上。已发现的参与细胞周期调控的microRNA已有10余种，其中miR-1-2与miR-34分别靶向CDK4，细胞周期被停滞于G1期，近而抑制肿瘤细胞增殖[13-15]；miR-22靶向CDK6细胞周期停滞于G1期，诱导乳腺癌细胞衰老。在不同的生物学过程中，这些miRNA通过靶向E2F、CDK、cyclin、p21、p27、DNA多聚酶α等促进或阻滞细胞周期的关键调节因子，进而调控细胞周期的进程。

1.2 外源性小分子抑制剂

外源性的抑制剂包括反义核酸、抗体、小分子RNA干扰（siRNA）和小分子化合物四种。小分子化合物是最主要的一类外源性CDK抑制剂。

1.2.1 小分子化合物 近几年来，由于对晶体结构的了解允许人们进行分子模拟研究，在设计开发高效、有选择性的CDKs化学抑制剂的研究方面取得了突破性进展，可以说这类化合物每天都有新的成员在增加[15-17]。目前小分子CDK抑制剂可分为以下13类：（1）嘌呤类（Roscovitine and Olomoucin）、（2）嘧啶类（PD-033299）、（3）黄酮类（Flavopiridols）、（4）噻唑类（SNS-03）、（5）吲哚类及其衍生物（SU951）、（6）哌酮类（Paullones）、（7）咪唑并吡啶、吡唑并吡啶类（AZ703），（8）吡嗪类（AT751）、（9）丁酸内酯类（butyrolactone-1），（10）十字苞碱类（UCN-01）等13种，其中发展较快的为嘌呤类、嘧啶类、氨基噻唑类、黄酮类、吲哚咔唑类似物、Paullones、靛玉红及其衍生物和吡嗪类。已有13个小分子抑制剂进入临床实验阶段。它们都是平面杂环的小分子化学物，与ATP竞争性地结合在CDK激酶的ATP结合位点上。如Seliciclib[CYC202，（R）-roscovitine]是一个2，6，9-三元取代的嘌呤类似物，选择性抑制CDKs/Cyclins，尤其是对CDK2/cyclinE的抑制作用最强。在体外对激酶活性的影响IC50值分别为CDK1/cyclinB（2.69μM）、CDK2/cyclinA（0.71μM）、CDK2/cyclinE（0.10μM）、CDK4/cyclinD1（14.21μM）、CDK7/cyclinH（0.49μM）、ERK-2（1.17μM）、PKA>50μM、PKC>100μM和SAPK>20μM。在体外，CYC202对多种人肿瘤细胞株的增殖有抑制作用，如乳腺癌、前列腺癌、肺癌等。IC50值范围是7.9～30.2μM，在24h，达到80%凋亡率时，CYC202浓度是20μM。对正常细胞的毒性明显低于对癌细胞的毒性，IC50在22.2～100μM这个范围。CYC202能抑制凋亡抑制基因的表达，通过抑制MDM2的表达，阻滞p53的降解，诱导肿瘤细胞周期停滞G1/S与G2/M期，降低pRb的磷酸化水平，诱导细胞周期各个时相的细胞凋亡。体内实验表明，CYC202耐药性好，口服生理活性良好，对由人结肠癌、子宫癌细胞接种裸鼠体内的实体瘤有明显的抑制作用。CYC202正在进行2个Ib期剂量增加的临床实验，在Ib期研究中发现，10例患有卵巢癌的患者服用CYC2024个月以上，肿瘤没有增加和严重的治疗相关的副作用，其中1个患者的肿瘤缩小了30%以上，治疗1年以上的患者病情稳定。Ⅱ期临床研究发现，CYC202单独应用效果稍差，与其他化疗药物联合应用治疗效果显著。CYC202联合卡培他滨治疗乳腺癌，联合2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷或顺铂治疗肺癌、鼻咽癌的IIb期临床实验也在进行[18-24]。

1.2.2 小分子RNA干扰 小分子RNA干扰技术的发展和应用，使特异性的干预靶分子的基因表达的研究成为可能，有不少科学家开始从基因水平干预CDK/Cyclin的合成。Lima等[25-26]将靶向CyclinE的siRNA转染到肝癌细胞Hep3B、HepG2、SNU449（CyclinE过表达），HuH7（CyclinE没有过表达）后发现，在过表达CyclinE的细胞中，CyclinE的表达下降了90%，DNA合成明显下降，细胞发生凋亡。Galimberti等[27]将分别靶向CyclinE、CDK2、CDK1的siRNA转染鼠肺癌细胞HOP-62、H-522、H-23后，发现CyclinE/CDK2能引起细胞凋亡，抑制肺癌细胞的增殖，而CDK1siRNA对细胞凋亡无影响。CDK1 siRNA干扰导致的CDK1表达降低只引起细胞期阻滞，细胞增殖减慢；而CDK1和CDK2 siRNA的共同干扰作用导致的CDK1、CDK2表达同时降低，引起细胞周期S期和G2/M期的阻滞，同时诱导了细胞的凋亡。曹银芳等[28]成功将靶向CDK2/CyclinE的siRNA重组表达载体转染肝癌HepG2细胞后，发现CDK2和CyclinE mRNA表达显著下降，细胞周期停滞于S期发生阻滞，G1期细胞明显增多，Caspase-3活性增强，HepG2细胞发生了凋亡，并且细胞周期的改变与转染后HepG2细胞体外增殖力下降是一致的。

2 问题与展望

CDK1，CDK2，CDK4，CDK6是热门的抗癌靶标，但由于激酶ATP结合位点高度的保守性，选择性小分子抑制剂的设计与开发是一个公认的难题。因激酶结构的保守性而产生的耐药性和毒副作用，严重阻断了化疗药物的抗肿瘤效应，限制和影响了治疗的效果。研究发现CDKs/Cylcins抑制剂的临床应用出现的最大问题是肿瘤的耐药性导致了肿瘤的复发，疗效明显降低。其抗性的产生与该致癌激酶基因的扩增、补充途径及信号通路的反馈调节相关。此外，其抗性还与药物靶点的单一或群体突变有关，导致了药物与靶点的亲和性差。

siRNA药物诱导的RNAi具有特异性和高效性，是对成瘾性致癌基因实施靶向治疗的理想选择。研究发现，化疗药物与siRNA联合作用于肿瘤细胞，具有协同作用，基因治疗可作为化学治疗药物外的补充途径。Wang等[29]发现，用livin-siRNA表达载体转染肿瘤细胞导致livin基因沉默后，可激活caspase-3并增加肿瘤细胞对紫外线等其他促凋亡刺激信号的敏感性。用RNAi技术下调bcl-2或XIAP基因表达，可增加人乳腺癌细胞MCF-7依托泊苷及阿霉素的敏感性，表现为肿瘤细胞的数量与活性下降、凋亡率增加，较单一化疗药物处理组活性细胞数目明显减少。Chistiane等[30]将针对多药耐药基因MDR1编码的P-gp-siRNA转染人胰腺癌细胞EPP85-181RDB和人胃癌细胞EPG85-257RDB，发现上述细胞对柔红霉素的耐药性分别下降了89%和58%。具有MDR特性的K562细胞经上述siRNA处理后，也观察到类似效果。因此，siRNA干扰技术可能是解决临床上药物抗性的主要手段之一。

CDK及其相关蛋白表达异常与肿瘤的发生和发展密切相关。不少外源性或者是内源性的CDK抑制剂在抑制CDK后，都能很好的抑制肿瘤的发生和发展。然而单独CDK抑制剂治疗，会有肿瘤逃逸的现象，而无法根治肿瘤。因此与其他治疗手段联合的治疗方式，将是CDK抑制剂研究的方向之一。

[参考文献]

[1] Yao G，Lee TJ，Mori S，et al.A bistable Rb-E2F switch underlies the restriction point[J].Nature Cell Biology，2008，10（4）：476-482.

[2] Garrett MD and Fattaey A.CDK inhibition and cancer therapy[J].Current Opinion in Genetics & Development， 1999，9（1）：104-111.

[3] Lapenna S， Giordano Antonio.Cell cycle kinases as therapeutic targets for cancer[J].Drug Discovery，2009，8（1）：547-566.

[4] Shapiro GI.Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment[J].Journal of Clinical Oncology，2006，24（11）：1770-1783.

[5] Malumbres M，Barbacid M.Cell cycle，CDKs and cancer：a changing paradigm[J].Nat Rev Cancer，2009，9（3）：153-166.

[6] Malumbres M，Barbacid M.Mammalian cyclin-dependent kinases[J].Trends Biochem Sci，2005，30（11）：630-641.

[7] Vermeulen K，Bockstaele DRV，Berneman ZN.The cell cycle： a review of regulation， deregulation and therapeutic targets in cancer[J].Cell Prolif，2003，36（3）：131-149.

[8] Senderowicz AM.Targeting cell cycle and apoptosis for the treatment of human malignancies[J].Current Opinion in Cell Biology，2004，16（6）：670-678.

[9] Fleming IN，Hogben M，Frame S，et al.Synergistic inhibition of ErbB signaling by combined treatment with seliciclib and ErbB-targeting agents[J].Clin Cancer Res，2008，14（13）：4326-4335.

[10] Dent P，Curie DT，Fisher PB，et al. Synergistic combinations of signaling pathway inhibitors：Mechanisms for improved cancer therapy[J].Drug Resist Updat，2009，12（3）：65-73.

[11] Jung YJ，Lee KH，Choi DW.Reciprocal expressions of cyclin E and cyclin D1 in hepatocellular carcinoma [J].Cancer Letters，2001，168（1）：57-63.

[12] Green SR，Frame S，Watt K，et al.Identification of pharmacodynamic biomarkers for CYC202 （R-roscovitine），a cyclin dependent kinase inhibitor[J].Proc Amer Assoc Cancer Res，2004，45（1）： 1442-1451.

[13] Keyomarsi K，O'Leary N，Molnar G，et al.Cyclin E，a potential prognostic marker for breast cancer [J].Cancer Research，1994，54（1）：380-385.

[14] Hwang HC，Clurman BE.Cyclin E in normal and neoplastic cell cycles[J].Oncogene，2005，24（1）：2776-2786.

[15] Freemantle SJ，Liu X，Feng Q.Cyclin Degradation for cancer therapy and chemoprevention[J].Journal of Cellular Biochemistry，2007，102（2）：869-877.

[16] Bettayeb K，Oumata N，Echalier A，et al.CR8，a potent and selective， roscovitine-derived inhibitor of cyclin-dependent kinases[J].Oncogene，2008，27（1）：5797-5807.

[17] Misra RN.Clinical progress of selective cyclin-dependent kinase（CDK）inhibitors[J].Drugs of the Future，2006，31（1）：43-52.

[18] 翟德忠，黄强.细胞周期蛋白依赖性激酶cdc2与恶性肿瘤发生发展的研究[J].肿瘤，2006，26（5）：489-491.

[19] Noble MEM，Endicott JA，Johnson LN.Protein kinase inhibitors：insights into drug design from structure[J].Drug discovery，2004，303（5665）：1800-1805.

[20] Hsieh WS，Soo R，Peh BK，et al.Pharmacodynamic effects of seliciclib，an orally administered cell cycle modulator，in undifferentiated nasopharyngeal cancer[J].Clin Cancer Res，2009，15（4）：1435-1442.

[21] Mcclue SJ，Blake D，Clarke R，et al.In Vitro and in Vivo antitumor properties of the cyclin dependent kinase inhibitor CYC202 （R-Roscovitine）[J].International Journal of Cancer，2002，102（5）：463-468.

[22] Meijer L，Raymond E.Roscovitine and Other Purines as kinase inhibitors.From starfish oocytes to clinical trials[J].Accounts of Chemical Research，2003，36（6）：417-425.

[23] Aldoss IT，Tashi T，Ganti AK.Seliciclib in malignancies[J].Expert Opinion on Investigational Drugs， 2009，18（12）：1957-1965.

[24] Appleyard MVCL，Neill1 MAO，Murray KE，et al. Seliciclib （CYC202，R-roscovitine） enhances the antitumor effect of doxorubicin in vivo in a breast cancer xenograft model[J].International Journal of Cancer， 2009，124（2）：465-472.

[25] Lima RT，Martins LM，Guimaraes JE，et al.Specific downregulation of bcl-2 and xIAP by RNAi enhances the effects of chemotherapeutic agents in MCF-7 human breast cancer cells[J].Cancer Gene Therapy，2004，11（1）：309-316.

[26] Li K，Lin SY，Brunicardi FC，et al.Use of RNA Interference to Target Cyclin E-overexpressing Hepatocellular Carcinoma[J].Cancer Research，2003，63（1）：3593-3597.

[27] Galimberti F，Thompson SL，Liu X，et al.Targeting the Cyclin E-Cdk-2 complex represses lung cancer growth by triggering anaphase catastrophe[J].Clin Cancer Res，2010，16（1）：109-120.

[28] 曹银芳，关泽红，刘新风.靶向CDK2、cyclinE的siRNA对HepG2细胞周期及凋亡的影响[J].内蒙古 医学院学报， 2009，3l（3）：191-194.

[29] Wang R，Lin F，Wang X，et al.Silencing Livin gene expression to inhibit proliferation and enhance chemosensitivity in tumor cells[J].Cancer Gene Therapy，2008，15（1）：402-412.

[30] Chistiane Nieth，Axel Priebsch，Alexandra Stege，et al.Modulation of the classical multidrug resistance （MDR）phenotype by RNA interference RNAi）[J].FEBS letters，2003，545（2-3）：144-150.

（收稿日期：2014-04-16）