RNAi沉默HMGA1基因对肝癌细胞凋亡和细胞周期的影响

【摘要】 目的：筛选hmga1基因沉默稳定转染肝癌细胞株，检测沉默后肿瘤细胞凋亡、周期和增殖的变化。方法：靶向hmga1的rnai载体转染肝癌细胞，g418筛选得到稳定转染细胞株并鉴定； mtt法和facs检测细胞增殖、凋亡及细胞周期。结果：成功建立基因沉默hmga1稳定细胞株；hmga1基因沉默后，细胞凋亡百分率（29.46±3.04%）明显高于质粒对照组和空白对照组 (1.96±0.76%和2.04±0.70%，p<0.01)；g0?g1期细胞百分率（75.21±2.35%）明显高于质粒对照组和空白对照组（37.98±3.02% 和39.23±3.63% ，p<0.01），g2?s期（24.79±2.35%）显著低于质粒对照组和空白对照组（62.03±3.01% 和60.77±3.63% ，p<0.01）；mtt检测显示，hmga1沉默细胞增殖与质粒对照组和空白对照组相比显著降低（p<0.01或0.05）。结论：基因沉默hmga1可促进肿瘤细胞凋亡，抑制细胞增殖。

【关键词】 rnai hmga1 细胞凋亡 细胞周期

effects of hmga1 silence by rna interference on the apoptosis and cell cycle of hepatocarcinoma cells

zhu ming?guang,zhang xin,yuan hong?yan,yang wei,chang ya?ping.

department of immunology, basic medical college of jilin university, changchun 130021,china

［abstract］objective:to develop hmga1?silencing smmc?7721 cell and investigate its impacts on apoptosis and cell cycle in tumor cells.methods:constructing hmga1?silencing smmc?7721 cell through g418 selection of rnai plasmid transfected cells;surveying the apoptosis,prliferation and cell cycle of the tumor cells by facs and mtt.results:stable hmga1?silencing cells were obtained successfully.the apoptosis percentage in rnai group（29.46±3.04%） was significantly higher than that in the negative control (1.96±0.76%) or control (2.04±0.70%)within each p<0.001；the cells in g0? g1 phase were 75.21±2.35%,notably higher than in the negative control and control.（37.98±3.02% and 39.23±3.63% respectively，p<0.01），and cells in g2?s phase（24.79±2.35%） of hmga1?silencing were remarkably fewer than in both the controls（62.03±3.01% and 60.77±3.63% respectively，p<0.01）.mtt detection showed that cell proliferation in rnai group was significantly lower than in both the controls（p<0.01 or 0.05）.conclusion:the silencing of hmga1 by means of eukaryotic expression plasmid can increase the apoptisis of smmc?7721 cell, suppress its proliferation and slow its growth.

［key words］ rna interference; hmga1; apoptosis; cell cycle

高迁移率族蛋白a1(high mobility group a1, hmga1)是位于细胞核内的小分子非组蛋白，参与细胞多种重要生物学过程，包括基因转录调控、胚胎发生、细胞分化、肿瘤形成和转移等。hmga在胚胎期表达丰富，而在成熟组织中则表达极少或缺失。但在病理情况下，相当多的恶性肿瘤组织中均发现有hmga1的高水平表达，并且其表达量与肿瘤恶性程度及转移能力成正相关[1]。hmga1基因的过强表达是诱发肿瘤的重要因素[2]。rna干扰（rna interference, rnai）是由与靶基因序列同源的双链rna引发的序列特异性基因转录后沉默过程，是目前最为高效特异的基因沉默手段。本研究选择hmga1分子作为干扰靶点，筛选建立基因沉默hmga1稳定转染肿瘤细胞，并检测沉默该基因后对肿瘤细胞凋亡和细胞周期的影响，为进一步研究hmga1基因在肿瘤细胞生物学特性及免疫抑制中的作用构建技术平台。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人肝癌细胞smmc?7721(本教研室留存)，在含10%小牛血清的dmem （gibco公司）培养基中370c，5％ co2孵箱(sanyo)培养。按4×105个细胞/ well将细胞铺于6孔培养板,待细胞长至70% 融合时转染。

1.2 细胞转染与筛选

pu6mrfp质粒由韩国ulsan大学yoon博士惠赠，pu6mrfp sirna?hmga1质粒由本室构建[3]。用polyfect将质粒与pcdna3以5：1比例共转染smmc?7721细胞，转染方法按qiagen公司试剂盒说明书操作。转染后待细胞生长接近融合时按1：4传代，继续培养细胞至50%～70%融合。弃培养液，更换浓度为800 μg/ml的g418培养液筛选，以未转染细胞作对照。对照细胞全部死亡时再更换一次筛选液，降低g418浓度至200 μg/ml维持筛选；抗性细胞克隆长大后移至24孔板培养，得到稳定转染细胞株，命名为rnai组细胞；空载体转染细胞作质粒对照。以smmc?7721细胞为空白对照，流式细胞仪(facscan, becton dickinson)检测荧光载体转染效率。

1.5 细胞总rna提取及rt?pcr 检测基因沉默效果

trizol法提取细胞总rna,按takara反转录试剂盒说明书合成cdna第一链。以cdna第一链为模板，pcr反应扩增hmga1和gapdh，引物参见文献[3]；hmga1 30个循环，gapdh 25 个循环。pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪（image master, pharmacia biotech,usa）紫外线下检测并拍照，比较各组灰度变化。

1.6 流式细胞仪检测细胞周期

将各组细胞以2×104 /well密度接种6孔板上72小时，待生长接近融合时用0.25% 胰蛋白酶消化， hanks液洗涤，800 r/min离心5分钟，弃上清，余液悬浮细胞，加入预冷70% 酒精固定过夜。上机前pbs洗一次，加pi染液核染色30分钟，上机检测。每组细胞重复3个样本。

1.7 mtt法检测细胞增殖

将各组细胞以2 000个/well的密度接种于96孔板，体积200 μl/well。从接种后当天开始进行mtt检测, 酶标仪(bio?rad,model550)570 μm 处测od值。连续测8天,每个时间点设5复孔。根据吸光度值绘制曲线，比较各组细胞生长速度的变化。

1.8 统计学分析

实验数据用microsoft excel进行分析处理；样本显著性分析用组间比较t 检验。

2 结果

2.1 荧光载体转染效率

facs检测显示，质粒对照组和rnai组转染效率均在90%以上，说明质粒转染效果良好。

2.3 sirna抑制hmga1基因的rt?pcr检测

rt?pcr产物电泳显示，质粒对照组hmga1 mrna表达未受抑制，与空白对照组无显著差异；而rnai组hmga1 mrna表达与对照组相比则明显受到抑制，说明rna干扰载体构建有效，能够有效地抑制转染细胞中hmga1mrna的表达（见图1）。

2.4 sirna对转染细胞凋亡的影响

facs检测显示：rnai组在g1期前有明显的凋亡峰存在,凋亡细胞百分比为29.46±3.04%，显著高于质粒对照组和空白对照组(1.96±0.76%和2.04±0.70%，p<0.01；见图2 )。

2.5 sirna对细胞周期与增殖的影响

facs检测显示，rnai组g0?g1期细胞百分数（75.21±2.35%）显著高于质粒对照组和空白对照组(37.98±3.02% 和39.23±3.63% ，p<0.01)，而g2?s期细胞(24.79±2.35%)则显著低于其他两组(62.03±3.01% 和60.77±3.63% ，p<0.01；见图3)。mtt法检测显示，各组细胞生长在培养的前5天内无显著差异。自第6天开始， rnai组细胞增殖明显低于两对照组（p<0.01或0.05），这种变化一直持续到第8天实验结束；两对照组间未发现有显著差异（p>0.05，见图4）。

3 讨 论

hmga1是结构性转录因子，能调控多种基因转录，这些受调控的基因中有许多直接参与肿瘤形成和转移[1]；hmga1抑制p53基因的抑癌活性，阻止细胞对损伤dna的修复，过度活化ras/erk 信号转导通路等，这些都是肿瘤生长的重要促进因素[4-6]。最近的研究发现，hmga1可通过诱导胰岛素受体表达增加肿瘤恶性程度和转移倾向[7]。鉴于hmga1在肿瘤发生发展中的重要作用，沉默该基因可能对肿瘤细胞生物学行为产生重要影响。

本实验用靶向hmga1的rnai质粒转染mmc?7721细胞，筛选基因沉默hmga1稳定转染细胞，采用facs检测转染效率和rt?pcr检测hmga1 mrna表达鉴定筛选成功，以此为技术平台采用mtt法和facs检测肿瘤细胞生长和细胞周期。结果显示：hmga1基因沉默后肿瘤细胞生长速度显著低于对照组细胞；g0?g1期细胞百分率显著高于对照组，g2?s期细胞百分率显著低于对照组；g1期前有凋亡峰存在，且凋亡细胞百分数显著高于对照组，说明基因沉默hmga1抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡。

总之，本实验建立了研究基因沉默hmga1肿瘤细胞的技术平台，发现hmga1可调控肿瘤细胞生长和凋亡，其机理及基因沉默hmga1后对肿瘤细胞免疫抑制等方面的影响还有待于后续实验研究。

【参考文献】

1 evans a, lennard t w,davies b r.high?mobility group protein 1(y): metastasis?associated or metastasis?inducing\[j\].j surg oncol,2004 ;88(2):86?99.

2 reeves r,beckerbauer l. hmgi/y proteins: flexible regulators of transcription and chromatin structure\[j\]. biochim biophys acta,2001;1519(1-2):13?29.

3 朱明光，张 鑫，袁红艳 et al.靶向高迁移率族蛋白a1基因rna干扰真核表达载体的构建.中国生物制品学杂志\[j\].2007；20（1）：1?7.

4 frasca f, rustighi a, malaguarnera r et al. hmga1 inhibits the function of p53 family members in thyroid cancer cells\[j\]. cancer res,2006;66(6):2980?1989.

5 adair j e, kwon y, dement g a et al. inhibition of nucleotide excision repair by high mobility group protein hmga1\[j\]. j biol chem,2005;280(37):32184?3292.

6 treff n r, pouchnik d, dement g a et al. high?mobility group a1a protein regulates ras/erk signaling in mcf?7 human breast cancer cells\[j\]. oncogene,2004 ;23(3):777?785.

7 paonessa f, foti d, costa v et al. activator protein?2 overexpression accounts for increased insulin receptor expression in human breast cancer\[j\]. cancer res,2006 ;66(10):5085?5093.