自体骨髓间充质干细胞联合自体外周血造血干细胞移植治疗恶性实体瘤

摘 要：目的：观察自体骨髓间充质干细胞（MSCs）联合自体外周血造血干细胞（APBSCs）移植治疗恶性实体瘤，探索肿瘤治疗学的新方法。方法：采用无血清培养体系体外培养MSCs，预处理方案为全身照射加大剂量化疗或大剂量化疗，将自体骨髓MSCs与APBSCs共移植治疗13例恶性实体肿瘤患者（联合移植组），并与同期进行的13例未联合MSCs的自体外周血造血干细胞移植的恶性实体瘤患者（对照组）对比，动态观察移植后造血恢复，及移植相关并发症。结果：联合移植组的患者造血恢复中性粒细胞≥ 0.5×109/L时间平均13.31d，血小板≥ 20×109/L时间平均14.25d，较对照组恢复快（P < 0.05）；血清丙氨酸氨基转移酶和血清天门冬氨酸氨基转移酶较对照组低（P0.05）。结论：自体MSCs与APBSCs联合移植治疗恶性实体瘤安全可行，移植后造血重建快，无明显副作用、肝功能损害恢复快。

关键词：间充质干细胞；造血干细胞；移植；实体瘤

造血干细胞移植（HSCT）支持下大剂量化疗（HDC）技术是近年来恶性肿瘤治疗学的重要进展，其治疗反应率明显优于常规化疗已被多数文献报告证明，但已有研究显示[1]，细胞毒性药物和放射治疗能严重破坏骨髓微环境，尤其是基质细胞，其损伤持久而难以恢复，故单纯进行HSCT患者造血重建困难，造血重建的速度与质量是移植技术成功的关键。骨髓间充质干细胞（MSCs）是骨髓基质细胞的前体细胞，它与骨髓微环境有密切的关系，MSCs具有多向分化潜能，能被诱导分化为骨髓微环境成分，如骨、脂肪和基质等，在长期骨髓细胞培养中，体外扩增的间充质干细胞（MSCs）具有支持长期培养启动细胞（LTCIC）的功能[2]，2006年5月至2009年03月，笔者采用自体骨髓MSCs和APBSCs联合移植治疗恶性实体瘤，观察其可行性、有效性和并发症发生情况，探索MSCs和APBSCs联合移植+HDC治疗恶性实体肿瘤。

1资料与方法

1.1 一般资料 自体骨髓MSCs和APBSCs联合移植治组（联合移植组）：恶性实体瘤患者共13例，男4例，女9例，中位年龄49岁（19～60岁），其中乳腺癌6例、NHL3例、肺癌3例，卵巢癌1例。6例乳腺癌均接受乳癌根治术或改良根治术，1例卵巢癌，3例肺癌患者均切除瘤体并行淋巴结清扫，其他病人移植前未做手术治疗，详细资料见表1。单纯自体外周血造血干细胞移植组（对照组）：恶性实体瘤患者共13例，男5例，女8例，中位年龄50岁（18～68岁），其中乳腺癌6例、NHL3例、肺癌2例，卵巢癌2例。6例乳腺癌均接受乳癌根治术或改良根治术，2例卵巢癌，3例肺癌患者均切除瘤体并行淋巴结清扫。详见表2两组患者移植前血清丙氨酸氨基转移酶，（ALT）和血清天门冬氨酸氨基转移酶（AST）均值比较差异无统计学意义（P >0.05）。

1.2 方法

1.2.1 自体骨髓间充质干细胞的采集、分离、培养扩增 无菌操作抽取骨髓液20 m，l肝素抗凝后，加入等量的无Ca2+、Mg2+的Hanks液，室温下加入密度为1.073g/ml的PercoⅡ液， 梯度离心（900 g，30 min），分离出单个核细胞（MNCs），用0. 8% NH4Cl和0. 1%NaHCO3裂解液处理1～2次，以破坏红细胞， 900 g离心5min，细胞部分用PBS洗涤2次，弃上清液，加入5 ml的Mesen-Cult培养液，计数并调整细胞数，按（2～5）×106/ml接种于75？培养皿中，置37℃、5% CO2和95%相对湿度的培养箱中，24 h后更换培养液，以后每3～4 d换液1次，直至2周，进行传代。MSCs呈单层贴壁生长，待细胞覆盖培养面达90%左右时用0. 25%胰酶消化，置于37℃中3～4 min，收集细胞于Mesen-Cult培养液中， 900 g离心5 min，弃上清液，将细胞再悬浮于培养液中， 按2×105/ml传代， 回输时MSCs数为（0.9～2.2）×106/kg ，细胞冻存采用10%二甲基亚砜、20%人血白蛋70%DMEM-LG体系， 4℃ 30 min，-20℃ 1 h后转移至-80℃低温冰箱。

1.2.2 APBSCs的动员、采集与冻存 两组患者造血干细胞（HSCs）动员均采用化疗联合粒细胞集落刺激因子（G-CSF）方案。采用MSC+或CS3000或Cobe Spectra血细胞分离机采集HSCs，对采集物进行MNCs计数和CD34+细胞测定。采集的MNCs（2.59～4.55）×108/kg、CD34+阳性细胞（4.27～8.89）×106/kg。HSCs悬液与含10%人血白蛋白的CP-1细胞冻存保养液1∶1混合，置于-80℃深低温冰箱保存备用。

1.2.3 预处理与回输 联合组及对照组共有13例采用钴60全身照射（TBI）加大剂量联合化疗，13例不含TBI。TBI总剂量7.9～8.3GY，肺部剂量

1.2.4 移植并发症防治 预处理过程中给予水化、利尿、美丝钠等预防出血性膀胱炎，予呋喃西林、碳酸氢钠漱口防治口腔溃疡，口服氟哌酸、黄连素、氟康唑防治真菌感染，合并细菌感染者予抗生素。还原型谷胱甘肽护肝等处理。

1.2.5 肝功能损害监测 分别在移植前和移植后

1、2、4周测定血清ALT和AST。

1.3统计学处理 数据用SPSS 13.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，以P

2结果

2.1移植后血象恢复时间比较 联合移植组和对照组中性粒细胞（ANC）≥0.5×109/L天数：（13.31± 3.04）d vs （26.54 ±4.37）d；联合移植组和对照组血小板计（PBC）≥20×109/L 天数：（14.25 ±3.32）d vs （27.92 ± 3.75）d。差异均有统计学意义（P0.05）。

2.2移植相关并发症

2.2.1 ALT与AST变化 见表3，移植后第1周两组之间ALT和AST值无明显差异，第2、4周联合移植组ALT和AST值明显低于对照组，（P0.05）。

表3：移植相关ALT与AST变化比较（n=13） X（一）±s，U/L

2.2.2并发症发生率 联合移植组和对照组口腔溃疡发生率分别为46.2%（6/13）和38.5%（5/13），（P>0.05）感染发生率分别为30.8%（4/13）和38.5%（5/13）， （P>0.05）腹泻发生率分别为15.4%（2/13）和23.1%（3/13），差异均无统计学意义（P>0.05）。

3讨论

造血干细胞移植（HSCT）支持下大剂量化疗（HDC）技术应用于治疗恶性肿瘤常常遇到的困难是造血重建延迟或失败，移植前的预处理，使骨髓造血微环境尤其是基质细胞受损严重，移植过程可有多种并发症，是HSCs植入失败的重要原因[3]，骨髓间充质干细胞（MSC）是骨髓基质细胞的前体细胞，它与骨髓微环境有密切的关系[4]。基础研究已在体外成功分离培养出MSC，发现和证实了MSC可重建造血基质细胞和微环境，促进造血， 2002年12月开始，国内开展异基因HSC联合供者MSC移植治疗白血病的研究，初步结果显示安全有效[5-6] Koc等初步报道含血清体外培养扩增的MSC，联合自体HSC移植治疗乳腺癌患者，其造血植入明显加快。我们将患者自体骨髓MSCs体处扩增后与APBSCs联合移植，并与单纯APBSCs移植的恶性实体瘤患者进行比较，结果表明，联合移植组血象恢复时间明显短于对照组，提示骨髓MSCs联合HSCs移植可明显加速HSCs的植入，缩短造血重建时间。肝功能损害是APBSCs移植重要并发症之一，发生原因主要与预处理损伤、感染等因素有关，移植后肝功能的恢复情况直接影响移植的成败， 我们观察了MSCs联合APBSCs移植者与单纯APBSCs移植者的ALT和AST变化情况，结果显示，移植前和移植后第1周两组之间ALT和AST值无明显差异，第2、4周联合移植组ALT和AST值明显低于对照组，提示MSCs能促进肝功能损伤的修复，同时对比联合移植组及对照组口腔溃疡，感染，腹泻等移植并发症，二者之间无明显差异。

综上所述，MSC联合PBSC移植支持下大剂量化疗（ HDC）可用于治疗多种恶性肿瘤，具有造血恢复快、无明显副作用、肝功能损害恢复快等特点，值得在临床上应用。

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