磷脂酶D的抗逆特性及其活性检测研究

摘要：介绍了磷脂酶D（PLD）的研究现状及进展，包括其分类、来源和用途，详述了PLD的抗逆特性和相关作用机理及对PLD活性检测的最新方法，对PLD在科学研究中的发展前景进行了展望。

关键词：磷脂酶D（PLD）；抗逆特性；活性检测

中图分类号：Q55 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）05-0998-03

1 概述

1.1 磷脂酶概述

磷脂又称磷酸甘油脂，广义上是指磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺 （PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰丝氨酸（PS）和神经鞘磷脂（SM）的复合物，狭义上即为磷脂酰胆碱[1]，是构成生物细胞膜骨架的主要成分，对维持细胞结构的稳定具有重要意义，并且参与细胞代谢和神经细胞的信号传递，同时其水解产物能参与多种生理过程以及环境刺激所引起的细胞反应[2]，在细胞的生命活动中起着重要的作用。磷脂的降解酶有多种，而磷脂酶则是催化降解磷脂第一步反应的关键酶[3]，此过程是在植物细胞膜上普遍存在的信号转导途径。磷脂在磷脂酶作用下水解为脂肪酸、肌醇三磷酸（IP3）、磷脂酸（PA）、二脂酰甘油（DAG）及乙酰胆碱等。根据其水解磷脂的部位不同可以把磷脂酶分为5类，即磷脂酶A1（Phospholipase Al，PLA1）、磷脂酶A2（PhospholipaseA2，PLA2）、磷脂酶B（Phospholipase B，PLB）、磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）和磷脂酶D（Phospholipase D，PLD）[4，5]。

1.2 PLD的分类

PLD为磷脂酰胆碱磷脂水解酶，是磷脂酶的一种，用来催化水解磷脂末端的磷酸二酯键形成磷脂酸和亲水性的胆碱等[6]，其催化水解作用广泛存在于萌发种子、衰老器官、逆境胁迫及胞内信号转导中[7]。PLD属于多基因家族，具有多分子异质性，通过对拟南芥PLD基因进行序列相似性和生物特性的分析，将其分成6种类型12个成员，即α（3）、β（2）、γ（3）、δ、ε和 ζ（2）[8，9]，同理将大米的PLD基因分成6种类型17个成员，即α（8）、β（2）、δ（3）、ζ（2）、κ和ψ[10]。目前的研究发现，影响PLD活性的因素很多，包括温度、pH、盐类、溶剂以及底物的聚合状态等，不同来源的PLD有着不同的最适影响条件，比如植物中PLD的最适pH 5～6要比微生物中的最适pH 4～8范围窄[11]。PLD既具有水解特性，又具有转导特性，且其最基本的功能就是维持细胞膜的稳定性[12]，同时PLD具有较广的底物特异性，可以作用于多种底物磷脂及其衍生物，且对构成脂的碱基部分没有绝对的特异性要求[13]，相关研究表明，神经鞘磷脂可能是目前得知的惟一不能被PLD降解的磷脂[14]。

1.3 PLD的用途

PLD作为降解磷脂类物质的主要酶系，在各种细胞反应中扮演着重要的角色，包括细胞转移、受体的内吞作用、细胞分泌、细胞骨架重组等[15]，同时也在生活生产中得到广泛应用，比如在医药方面。PLD在工业方面可用于油脂精炼、磷脂改性等[16]。总之，PLD已经越来越得到人们的普遍关注。

2 PLD的来源

有活性的PLD最先是在1947～1948年由Hanahan等[17-19]从胡萝卜根和菠菜叶的提取物中得到的，但是由于其多样性及不稳定性，其活性一直没有得到充分利用，直到1994年Wang等[20]从萌发的蓖麻中通过系列试验得到有活性的PLD基因。迄今为止，从蓖麻、拟南芥、豇豆、甘蓝、烟草、水稻、玉米、番茄、黄瓜、甜瓜等多种植物中克隆到的PLD 基因及其功能已经被广泛研究。虽然PLD普遍存在于动物和植物中，但是由于来源于微生物的PLD种类繁多，多为外分泌表达和单亚基蛋白，容易大量快速制备且成本较低，因而逐渐成为提取磷脂酶的主要来源[5]。常见的产磷脂酶的微生物主要有产碱假单胞菌（Pseudomonas alcaligenes）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、黏质沙雷氏菌（Serratia marcescens ）、链霉菌（Streptomyces）和米曲霉（Aspergillus oryzae）等[21]，为了改变中国主要采用的微生物菌株由国外购买的现状[22]，研究人员已逐渐筛选培育出了一些高产磷脂酶的菌株。李军红等[23]通过平板初筛和摇瓶复筛的方法获得的高产菌株，经验证鉴定其为蜡状芽孢杆菌（Bacillu scereus），王金梅等[21]则得到的为无色杆菌属（Achromobacter sp.）细菌，同时对其进行脱胶处理，证明其有良好的应用前景。

3 PLD在抗逆反应中的作用

植物在低温干旱、机械损伤、病原等逆境胁迫下，可通过信号转导迅速启动响应机制来调节自身的生理状态，以产生适应性或抗逆性[24]。研究发现，许多逆境下的信号转导过程都与植物体内PLD的激活有关[25]，当一些病原菌侵染植物时，植物中的PLD的调节活动明显增强。近年来，磷脂酶在干旱、低温、机械损伤等逆境条件下的反应机理已逐渐被发现。

3.1 低温逆境

植物与外界环境接触的首要部位即为细胞膜，细胞膜是由磷脂双分子层构成的，蛋白质穿插在其中，磷脂作为细胞膜的主要成分，维持着细胞的结构和功能。当植物受到低温胁迫时，其细胞膜中的磷脂含量会随着低温胁迫的严重程度而发生变化，以适应外界环境的变化。磷脂酶作为降解磷脂的主要酶，其活性直接影响了细胞膜磷脂的含量，进而间接影响植物对低温的抵抗作用[26]。Welti等[27]的试验表明，经过低温处理后PLD基因缺失型植株膜离子渗漏率与野生型植株明显不同，而膜离子渗漏率是反映膜稳定性的重要指标，同时发现低温处理后的两种植株的膜成分均发生了明显的变化。曾正兵等[28]的试验同样证明在8～16 ℃的冻害胁迫下，PLDα缺失型植株的离子渗漏率不同于野生型，可见PLD基因主要通过影响膜的稳定性来抵抗低温环境。

3.2 干旱胁迫

当植物处于干旱状态时，为了维持体内的水分充足，由脱落酸（ABA）诱导气孔关闭的敏感性将会升高，从而气孔关闭，蒸腾作用会减弱，进而减少水分的流失。同时经过大量的试验研究发现，PLD参与ABA介导的信号转导途径。因此，在干旱条件下，PLD的活性增强，进而促使ABA诱导气孔关闭，使植株内的水分不会大量流失，更能适应干旱条件。Sang等[29]的试验表明，PLD基因抑制型植株叶片的蒸腾失水率显著高于野生型。孙磊[26]的试验表明，当PLD的活性增强时，植物的气孔导度显著下降，水分丧失明显减少，抗旱能力有所提高。由此可见，PLD基因主要通过参与水分胁迫条件下的气孔调节作用来影响植物的抗旱性。

3.3 机械损伤

PA是磷脂酶水解磷脂的产物，同时也是信号转导的第二信使，参与许多细胞内生化反应。植物中的PA不仅可以激活一些激酶来共同参与信号转导，也可以作为中间体来参与其他脂质体的合成[30]。当植物受到机械损伤时，PLD活性增强，PA含量显著增加，诱导细胞的信号反应，同时膜上的钙离子的含量也调节了PLD的含量，从而影响PA含量。Ryu等[31]报道，Ca2+会引起与膜结合PLD的增加，表明植物在干旱条件下Ca2+参与PLD的调控，赵宇瑛[32]的试验表明，植物在干旱条件下，细胞膜Ca2+含量减少，黄瓜PLD酶活性增强，进而PA含量显著增加。由此可见，植物通过膜上Ca2+的浓度来影响PLD和PA的含量，以达到抗旱效果。

3.4 其他

植物在受到其他逆境胁迫时，如病原微生物、植物激素等也会发生一系列的抗逆反应，如当植物遭受病原微生物侵害时，PLD会集中于微生物与质膜的接触部位，发生活性和定位的改变，以抵御病原菌的感染[33]。当植物遇到植物激素如乙烯时，部分植物激素激发PLD的生成，继而使PA的含量增加，共同作用来延缓植物的衰老过程。

4 PLD活性的检测

由于PLD在植物的信号转导、抗逆反应及植物油脱胶等方面有着重要作用，因此对PLD活性的研究逐渐成为人们关注的焦点，PLD活性的测定方法一般是以检测其催化磷脂水解所生成的产物的量为依据的，如分光光度法、化学发光法、滴定法、直接标记法等，当前最常用的方法主要有底物放射标记法、酶联比色法和高效液相色谱法等。

4.1 底物放射标记法

底物放射标记法是通过直接对PLD反应的底物进行标记而测定其活性[34]。它是PLD活性检测中最敏感的一种方法，且其结果稳定，准确性高，误差小，重复性好，但其试验过程具有放射性，易对操作人员身体造成伤害，对试验设备要求较高，所以较难普及。

4.2 酶联比色法

酶联比色法是以PLD催化水解磷脂酰胆碱末端的磷酸二酯键生成胆碱，进而生成的H2O2为基准进行测定PLD活性的一种方法[35]。该方法具有高效便捷、灵敏度高、危害性小和结果稳定的优点，但是耗费药品量大，操作繁琐，所以一般适用于在测定材料的PLD含量很低，且难于提取的情况。

4.3 高效液相色谱法

高效液相色谱法是以荧光标记的磷脂酰胆碱作为底物，利用转磷脂酰反应原理来测定PLD 活性的一种方法[36]。高效液相色谱法是一种简便、快速、准确、灵敏的方法，已被广泛地应用于PLD活性的检测，具有良好的科研和临床应用价值，是一种很好的测定PLD的方法。

4.4 试剂盒法

用上海杰美基因医药科技有限公司出售的PLD 总活性比色定量检测试剂盒来测定PLD的活性，操作简便，结果准确，可以被普遍应用。目前用于测定PLD活性的方法已越来越多，但在人们的日常科研中，由于测定的材料、目的及实验室条件限制等因素，应根据具体情况来选择适宜的测定方法。

5 前景与展望

PLD在人们的生活生产领域有着广泛的应用，虽然目前人们已经意识到PLD具有良好的发展前景，但是其来源仍然只局限于在植物和动物中提取，对微生物来源的研究甚少，同时对其活性的检测方法虽然很多，但是其或多或少存在不足，因此，要致力于培育优良的微生物菌种，以能大量提取PLD，并且要研究出更适合检测PLD活性的简便通用的方法，为PLD 的发展提供更好的依据。

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