应用逆转录病毒pLXSN-EGFP示踪观察电针任脉对MCAO大鼠SVZ区NSC增殖的影响

摘 要:目的:利用侧脑室注射pLXSN-EGFP在体示踪观察电针任脉对缺血侧SVZ区NSC增殖的情况,探讨电针任脉治疗缺血性脑损伤的作用机制。方法:将病毒上清注入MCAO大鼠侧脑室以标记新增殖细胞,并用Nestin免疫荧光染色法鉴定NSC,并计数不同时相缺血侧SVZ区NSC。结果:脑缺血后不同时相缺血侧SVZ区均有新增殖NSC,且电针任脉组有更明显的增加。结论:缺血可激发SVZ区NSC的增殖,电针任脉可起到明显促进作用,推论这种作用可能是是任脉的妊养和促进脑缺血后神经修复功能的重要机制。

关键词:反转录病毒;Nestin;电针任脉;神经干细胞

中图分类号:R245.97 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0010-03

Study on the Effects of Electroacupuncture at the Conception

Vessel on Proliferation of Neural Stem Cells in the Subventricular Zone by Retrovirus

Plasmid pLXSN-EGFP Tracer Technique in Brain Ischemia Rats

YANG Zhuoxin1,YANG Fuxia1,YU Haibo1,WANG Ling1 ,PI Min1,LUO Wenshu1,MA Xiaoming2

(1.Shenzhen Hospital of Chinese Medicine,Shenzhen 518033,Guangdong,China;

2.Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405,Guangdong,China)

Abstract:Objective:To observe the effects of electro-acupuncture(EA) at the Conception Vessel(CV) on the proliferation of neural stem cells by Retrovirus Plasmid pLXSN-EGFP Tracer Technique in Brain Ischemia Rats in the subventricular zone and to explore the mechanism of EA at the CV in treating ischemic brain injury.Methods: Each group was applied to intraventricular injection Retrovirus Plasmid pLXSN-mediated EGFP after MCAO to mark new proliferative cells and Nestin immunofluorescence staining was done to identify whether the cells were neural stem cells(NSCs)or not, and also he number of proliferating cell was observed in different time.Results: EGFP-positive and EGFP/ Nestin-positive were found in subventricular zone (svz)in different time after cerebral ischemia,on the 7th day remarkably increased(P

Key words:Retrovirus Plasmid pLXSN-EGFP; Nestin; Electroacupuncture at the Conception Vessel; Neural Stem Cell;Proliferation

近年研究表明在成脑侧脑室下区(subventrieularzone,SVZ)仍存在神经干细胞(neural stem cells,NSC)并不断分化为神经元和胶质细胞,使用某些干预措施可促进NSC增殖分化,并能改善某些功能缺陷症状[1,2],从而为脑中风的康复治疗带来了新希望。针刺是促进脑缺血康复的主要方法之一,其中临床治疗脑中风的验穴很多是任脉经穴,针刺任脉是促进脑缺血康复的重要方法之一,笔者在临床中也发现针刺任脉治疗缺血性脑中风疗效显著,中医理论认为任脉通“妊脉”,具有饪养和调节胚胎发育的生理作用,这两种生理作用是否与针刺任脉促进NSC的增殖从而对缺血性脑中风起效有关?为此本研究应用侧脑室注射逆转录病毒pLXSN-EGFP在体标记示踪新增殖的细胞,并对其进行Nestin检测以鉴定出NSC并以此探讨电针任脉促进缺血后神经修复的作用机制。

1材料和方法

1.1 实验设计

采用随机对照实验,实验主要在香港理工大学深圳研究院进行。其中实验设计和监督由第二作者完成,干预实施者由第一、三、五、六、七作者完成,第四作者进行盲法评估。

1.2 主要试剂和仪器

反转录病毒载体质粒pLXSN-EGFP(首都医科大学北京市神经再生修复研究重点实验室馈赠),高纯度细质粒小提中量试剂盒(北京TIANGEN公司),大肠杆菌DH5a(深圳大学生命科学院赠送),小鼠成纤维细胞PA317 及小鼠成纤维细胞NIH3T3(均购自上海中科院细胞库),脑立体定位仪,微量注射泵,冰冻切片机(德国Leica),激光共聚焦显微镜(德国Leica)等。

1.3 pLXSN-EGFP转染标记

1.3.1 制备病毒上清液 将质粒pLXSN-EGFP导入感受态细胞克隆后行DNA鉴定确定获得相同质粒。采用脂质体Lipo2000介导转染包装细胞PA317,经100~250 nmol/L的氨甲蝶呤(MTX)筛选出G418抗性克隆,用NIH3T3细胞经MTX抗性检测,获得高病毒滴度(154×105CFU/ML)的病毒上清液。

1.3.2 病毒在体转染 将MCAO大鼠剪开头顶皮肤,在立体定位仪上双耳固定,参照Paxinos和Watson[5]的大鼠脑立体定位图谱于前囟旁1.5mm及向后0.8mm处以牙钻钻孔,用微量加样器由孔内缓慢注入病毒上清,注毕留针15 min后缓慢退针,骨蜡封口,缝皮,消毒。模型组按上述同样方法和坐标处理。

1.4 实验动物分组与处理

成年健康雄性Wistar大鼠购自广州中医药大学实验动物中心,参照改良的Longa栓线法构建大鼠MCAO(局灶性脑缺血)模型。模型评分由专人进行盲法评估,模型成功判断标准参考Zea Longa[4]评定神经功能缺损程度法判断,模型制备完成后神经学症状评分高于1分纳入实验。将36只成功的MCAO大鼠随机分为模型组和电针任脉组,每组又分为7天、14天、28天3个亚组,每个亚组各6只。

电针任脉组于注射病毒后第2天开始电针治疗。参照《实验针灸学》(上海科学技术出版社,1999年9月第1版)选取任脉“关元、气海、承浆”穴,电针刺激10min,1天1次。电针仪采用上海医疗电子仪器有限公司制造的G6805-Ⅱ型电针治疗仪,电针负极同时接关元、气海两处,正极接承浆。模型组大鼠只予以同等条件抓取固定。

1.5 取材与观察

对到达时相点的大鼠采用心脏灌注固定法处死,取脑后行冰冻切片,片厚20um,将切片置于共聚焦显微镜下照相,用Leica图像分析系统采集图像并统计计数。

1.6 Nestin免疫荧光鉴定NSC

将上述观察后的切片入PBS冲洗,入过氧化氢后继续PBS冲洗,入50%甲酰胺(formamide)/2×枸橼酸钠杂交液(SSC)和PBS分别反复冲洗,经HCL处理后入硼酸缓冲液冲洗,以牛血清蛋白(BSA)封闭非特异性抗原,加入小鼠Nestin单克隆抗体过夜,继续PBS冲洗,加入羊抗小鼠IgG-Cy3红色荧光二抗(1∶400),PBS反复冲洗后裱片,甘油封片。用BSA代替一抗作为阴性对照,共聚焦显微镜下拍照计数统计。

2结果

2.1 脑缺血后不同时间两组大鼠缺血侧EGFP阳性细胞数目

SVZ区模型组EGFP阳性细胞数量在第7天时最多,第14、28天逐步下降且差异显著;电针任脉组各时相变化也存在同样趋势;但电针任脉组阳性细胞量在各时相均较模型组显著增加,见表1。

2.2 脑缺血后不同时间两组大鼠缺血侧EGFP/Nestin阳性细胞数目

其结果与EGFP阳性细胞数目呈相同变化,见表2。

3讨论

GFP是从水母分离的一种蛋白,在激发波长475nm,发射波长490nm的条件下呈绿色,具有较高的灵敏性,可耐受热、极端pH值及化学变性剂,无物种特异性、对受体细胞无毒害[6],目前常被用做报告基因和标记细胞[7-11],在GFP的基础上进行F64L和S65T突变后的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)进一步增强了GFP的荧光性能,使结果更容易观察检测[12]。pLXSN具有极高的转染效率(理论上对有丝分裂期的细胞转染率可达100%),且只能转染分裂细胞而对非分裂细胞的转染效率就很低几乎没有[13]。本研究用重组逆转录病毒pLXSN/EGFP标记脑内新增殖细胞,在荧光显微镜下能观察到绿色荧光。Nestin (神经巢蛋白)被作为NSC的特征性的生物学标记,免疫组化证实所有的NSC的Nestin均成阳性14,故同时表达Nestin和EGFP阳性绿色荧光细胞则即为新增殖的NSC。

实验观察到缺血可激发缺血侧SVZ区NSC的增殖,但电针任脉后后细胞增殖数量会显著增加,这和其他文献报道一致[14],说明电针任脉对缺血后NSC增殖有明显促进作用,尤其是在缺血后7天时NSC增殖数目甚至可以达到模型组的2倍,第14天、28天有减少趋势,这和笔者采用BRDU免疫荧光法结果一致[15]。

电针任脉可以明显促进缺血后脑区NSC的增殖,结合中医理论可以这样解释:任脉循行与督脉在脑部相接:“起于中极之下……与手足阳明,督脉会……系两目之下中央”,按照“经脉所过,主治所及”故与脑的生理病理密切相关;且任脉通“妊脉”,其妊养作用同样适用脑神经细胞,即电针任脉可促进脑内NSC的增殖,从而可以促进缺血后脑神经修复,由此笔者大胆推测电针任脉促进缺血后NSC的增殖是任脉会于脑和主妊养生殖作用的体现,是电针任脉促进脑缺血的神经修复功能的重要机制。

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