人类FOXL2基因突变谱的系统性研究

【摘要】 目的：通过对人类FOXL2基因突变谱研究，确定FOXL2基因突变分型及其与小睑裂综合征的相关性。方法：收集所有的突变，并对这些突变进行统计学处理并分类，进行蛋白表达谱分析，各功能区分析以及患者的临床特征与突变相关性分析。结果：根据分析，将FOXL2基因突变分为10型，各分型与小睑裂综合征患者的临床特征关系各不相同。单纯性卵巢功能早衰患者及单纯性上睑下垂患者与FOXL2基因突变无密切相关性。结论：FOXL2的突变与BPES发病密切相关，多聚丙氨酸区域的丧失与Ⅰ型BPES密切相关。FOXL2的突变与单纯性POF及上睑下垂的发病关系并不密切。

【关键词】 小睑裂综合征； FOXL2； 卵巢功能早衰； 突变

FOXL2基因是一个2.7 kb的单外显子基因，编码376个氨基酸，预期的蛋白质属于翼状螺旋/叉头型转录因子调节家族，包含一个特有的101个氨基酸的forkhead DNA结构域和一个与此分离但功能尚未阐明的多聚丙氨酸肽段。小睑裂综合征（BPES）是表现为睑裂狭小、上睑下垂和倒转型内眦赘皮等一系列症状的常染色体显性遗传病。临床上分为两型：Ⅰ型：女性患者不育，原发闭经或提前绝经、小子宫和卵巢功能早衰；Ⅱ型：男女患者均可生育。目前研究证实FOXL2基因与BPES的发病密切相关，是首选致病基因。

1 材料与方法

1.1 材料 参考The human FOXL2 mutation database（http：//medgen.ugent.be/foxl2/）[1]，搜集所有报道过的突变，共发现有144个变异位点，其中包括15个单核苷酸多态位点。对这些突变进行统计学处理并分类，同时进行蛋白表达谱分析，各功能区分析，以及患者的临床特征与突变相关性分析。

1.2 突变位点的研究方法 （1）直接测序；（2）多重性连接依赖的探针扩增法；（3）微卫星位点分析和单核苷酸多态性分析；（4）荧光原位杂交技术分析。

1.3 前期实验结果的分析 笔者对一期收集到的29例BPES患者血样进行FOXL2基因突变研究，并将前期实验中所得的突变结果进行分析归类[2-3]。

2 结果

2.1 FOXL2的功能区 FOXL2的功能区包括forkhead DNA结合域（第52～152残基区域）、功能尚未阐明的多聚丙氨酸肽段（221～234位氨基酸残基区）以及转录激活区（第280～320残基区域）。

2.2 分类结果 突变谱共分10型，具体分型如下：A：蛋白截短，无forkhead DNA结合域及其后的所有氨基酸；B：蛋白截短，包含部分forkhead DNA结合域；C：蛋白截短，包含完整forkhead DNA结合域，无多聚丙氨酸肽段及转录激活区；D：蛋白截短，包含完整forkhead DNA结合域和完整的多聚丙氨酸肽段，无转录激活区；E：转录激活区域突变，蛋白截短或延长，包含完整forkhead DNA结合域和完整的多聚丙氨酸肽段；F：转录激活区后的突变，蛋白截短或延长，包含完整forkhead DNA结合域、多聚丙氨酸肽段及转录激活区；G：多聚丙氨酸肽段框架内移码突变，蛋白延长或截短；H：只有错义突变，单个碱基的替换或颠换；I：包括微缺失及FOXL2基因与其他基因的染色体重排；J：其他突变，包括5′-UTR和3′-UTR区域变异。

2.3 患者的临床特征与突变相关性分析结果 所有发现突变的患者均为典型的BPES，两型BPES存在着基因型和表现型的相互关联。同一个突变可导致明显的家系内和家系间的表型多样性，即表现型和基因型的多样性。

A组突变由于forkhead区域的破坏致DNA结合能力的下降，从而导致FOXL2的单型缺陷；由于缺乏相关的信息，对B组不能作出相关性判断；C组，蛋白截短，无多聚丙氨酸肽段及多聚脯氨酸肽段，发生POF几率非常高，多为BPESⅠ型；D组，具有完整的forkhead和聚丙氨酸区域，蛋白截短，家系内存在表现型的多样性；E组，具有完整的forkhead和聚丙氨酸区域，移码突变导致蛋白延长，导致Ⅰ型和Ⅱ型BPES；F组的基因型与表现型亦不能作出相关性判断；G组的多聚丙氨酸肽段突变框架移码突变，导致聚丙氨酸扩增，发生在Ⅱ型BPES家系和类型不明确的家系中。多聚丙氨酸肽段延长，导致聚丙氨酸扩增，多发生在Ⅱ型BPES家系；H组错义突变，由于病例数量少及缺乏相关的信息，不能作出判断；I组发生在散发的患者和家族性BPES，多伴发智力低下；J组未引起任何蛋白变异，由于病例数量少及缺乏相关的信息，不能作出相关性判断。

单纯的卵巢功能早衰（POF）患者中发现的FOXL2的变异均为单核苷酸多态性（SNP），笔者对30例单纯性上睑下垂患者的FOXL2基因进行突变分析时未发现此基因的突变。

2.4 前期实验中的突变的分析及归类 笔者对一期收集到的29例BPES患者及100例眼睑发育正常的人的血样提取FOXL2基因进行突变研究，发现的3个突变位点分别为892C>T、951～953delC及901～930dup30。

892C>T为无义突变，蛋白截短，包含完整forkhead DNA结合域，但无多聚丙氨酸肽段及多聚脯氨酸肽段，属于C组；951～953delC为缺失突变后引起移码突变，蛋白截短，包含完整forkhead DNA结合域和多聚丙氨酸肽段，无多聚脯氨酸肽段，属于D组；901～930dup30为重复突变，多聚丙氨酸肽段框架内移位突变，蛋白延长，属于G组。

另外，据报道的中国人BPES患者中FOXL2基因的突变共有24种，除去笔者报道的3种[2-3]，其余21种分组情况如下：475dupC属于B组；704delG及804dupC属于D组；1091 delC属于E组；1041～1042 insC属于F组；909～938 dup30及933～965dup33属于G组；H组突变比较多，分别为425 T>C；773C>G；655C>T；370 A>G；340A>G；384G>A；241T>C；650C>G；50CTA及2293-2294insT属于J组；其中672～701dup30；663～692dup30以及858～874dup17不属于以上突变分型的任何分组，提示在这些突变区域可能存在其他功能部位[4-13]。

3 讨论

转录因子的转录激活区分为3类：酸性激活区、谷氨酰胺富含区和脯氨酸富含区。国内外学者对FOXL2功能区的研究只提出其forkhead DNA结合区和一个与此分离的多聚丙氨酸区域，并未提及转录激活区。通过对FOXL2功能域的分析，未发现明显的酸性区及谷氨酰胺富含区，只有一个脯氨酸富含区，即280～320区域，此区内脯氨酸含量高达45%，因此，笔者认为此区为FOXL2的转录激活区。另外，突变谱的结果亦显示此区域为突变高发区，认为是由于转录激活区的突变使转录因子失去转录功能而导致其作用蛋白的功能异常，从而导致疾病的发生。

突变类型的分组与De Baere等[14]的分组略有不同，笔者主要是根据FOXL2功能区进行突变类型的分组，如此可以更好的了解FOXL2突变与功能的关系，从而为明确FOXL2的确切致病机理提供依据。De Baere等[14]在对多例BPES家系研究后提出由同一个突变可导致明显的家系内和家系间的表型多样性，即表现型和基因型的多样性，笔者认为主要是由于基因背景不同和基因的相互作用造成的。

FOXL2控制睑裂发育的目标基因尚不清楚。据推测，FOXL2很可能是控制某些基因，如TGF-α、EGFr、Inhbb、控制睁眼及睑裂的基因位点，而这些基因与其他与眼前节发育有关的转录因子共同影响睑裂的发育，如Pax6、Bmp4、Bmp7等[15-16]。另外，有研究发现，FOXL2的一个同源基因FOXO对某些调节细胞周期的抗凋亡或促凋亡基因有调节作用。FOXL2可能参与了对胚胎早期眼睑及眼周肌肉发育过程中某些调节细胞周期的抗凋亡或促凋亡基因的调节，其具体的作用机制，还有待于进一步地研究证实。

综上所述，FOXL2的突变与BPES发病密切相关，任何区域的突变都可以导致其功能异常，从而导致BPES。多聚丙氨酸区域的丧失与Ⅰ型BPES密切相关。FOXL2的突变与单纯性POF及上睑下垂的发病关系并不密切。

参考文献

[1] Beysen D，Vandesompele J，Messiaen L，et al.The human FOXL2 mutation database[J].Hum Mutat，2004，24（11）：189-193.

[2] Tang S，Wang X，Lin L，et al.Mutation analysis of the FOXL2 gene in Chinese patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Mutagenesis，2006，21（1）：35-39.

[3] Li W X，Wang X K，Sun Y，et al.A novel mutation in the FOXL2 gene in a Chinese family with blepharophimosis， ptosis， and epicanthus inversus syndrome[J].Chinese Journal of Medical Genetics，2005，22（4）：372-375.

[4] Jiang H，Huang X，Su Z，et al.Genetic analysis of the forkhead transcriptional factor 2 gene in three Chinese families with blepharophimosis syndrome[J].Mol Vis，2013，19（2）：418-423.

[5] Ye J，Shi X，He J J，et al.Mutation analysis of FOXL2 gene in Chinese patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Chinese Journal of Ophthalmology，2011，47（11）：1007-1011.

[6] Hu S，Guo J，Wang B，et al.Genetic analysis of the FOXL2 gene using quantitative real-time PCR in Chinese patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Mol Vis，2011，17（5）：436-442.

[7] Zhou Z M，Liang D S，Quan Y，et al.Deletion and mutation analysis to FOXL2 in blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Chinese Journal of Ophthalmology，2010，46（6）：532-536.

[8] Lin W D，Chou I C，Lee N C，et al.FOXL2 mutations in Taiwanese patients with blepharophimosis， ptosis， epicanthus inversus syndrome[J].Clin Chem Lab Med，2010，48（4）：485-488.

[9] Wang J，Liu J，Zhang Q.FOXL2 mutations in Chinese patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Mol Vis，2007，13（8）：108-113.

[10] Qi Y H，Li Y，Lin H，et al.Mutation analysis of FOXL2 in Chinese patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Chinese Journal of Ophthalmology，2006，42（5）：409-414.

[11] FOXL2 mutations and genomic rearrangements in BPES[J].Human Mutation，2009，30（2）：158-169.

[12] Qian X，Shu A，Qin W，et al.A novel insertion mutation in the FOXL2 gene is detected in a big Chinese family with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus[J].Mutat Res，2004，554（1）：19-22.

[13] Qi Y H，Li Y，Lin H，et al.Mutation analysis of FOXL2 in Chinese patients with blepharophimosis-ptosis-epicanthus inversus syndrome[J].Chinese Journal of Ophthalmology，2006，42（5）：409-414.

[14] De Baere E，Beysen D，Oley C，et al.FOXL2 and BPES： mutational hotspots， phenotypic variability， and revision of the genotype-phenotype correlation[J].Nat Genet，2003，72（2）：159-166.

[15] Praphanphoj V，Goodman B K，Thomas G H，et al.Molecular cytogenetic evaluation in a patient with a translocation （3；21） associated with blepharophimosis， ptosis， epicanthus inversus syndrome （BPES）[J].Genomics，2000，65（5）：67-69.

[16] Schmidt D，Ovitt C E，Anlag K，et al.The murine winged-helix transcription factor Foxl2 is required for granulosa cell differentiation and ovary maintenance[J].Development，2004，131（25）：933-942.

（收稿日期：2014-06-12） （本文编辑：蔡元元）