浅析肝癌抗原肽（EPVTKAEML）与人HSP70融合基因的构建及原核表达

【摘要】

目的: 构建及原核表达肝癌抗原肽（epvtkaeml）与人热休克蛋白70（hsp70）的融合基因。方法: 采用加端pcr方法, 将epvtkaeml的基因序列融合到人hsp70基因的3′端; 将融合基因克隆入原核表达载体pet?28a(+)中, 构建重组质粒pet?28a(+)/epvtkaeml?hsp70。经限制性内切酶bamh i、 xho i双酶切鉴定及序列测定后, 转化e.coli bl21（de3）, 经iptg诱导表达融合蛋白, sds?page检测表达结果。结果: 应用加端pcr方法扩增出约2.0 kb的目的片段, 序列测定结果证实, epvtkaeml的基因序列成功地融合到人hsp70基因的3′端。经bamh i、 xho i酶切鉴定证实, 融合基因成功地克隆到原核表达载体pet?28a(+)上; 转入重组质粒的e.coli bl21（de3）经iptg诱导后, sds?page分析发现在相对分子质量（mr）约72000处有表达量明显增多的蛋白条带。结论: 成功地构建并表达了肝癌抗原肽（epvtkaeml）与人hsp70的融合基因。

【关键词】 肝肿瘤/免疫学 抗原 肿瘤/遗传学 表位 热休克蛋白类70/遗传学 基因表达

[abstract] aim: to construct and express a fusion gene of human heptoma peptide (epvtkaeml) with human heat shock protein 70 (hsp70). methods: a cdna fragment encoding epvtkaeml was added to 3 terminus of human hsp70 gene by pcr amplification. the pcr products of fusion gene were cloned into pet?28a(+)vector. the recombinant plasmid pet?28a(+)/epvtkaeml?hsp70 was identified by enzyme digestion analysis and sequencing, and then it was transformed into e.coli bl21(de3) through iptg induction to express the target protein bearing his tag. results: a fragment of about 2.0 kb was amplified by pcr. sequence analysis revealed that the sequence of epvtkaeml was connected successfully to 3 terminus of human hsp70. enzyme digestion analysis showed the fusion gene was cloned into pet?28a(+). sds?page showed that a mr 72 000 fusion protein was expressed. conclusion: the fusion gene of epvtkaeml?hsp70 has been successfully constructed and expressed in e.coli bl21(de3).

[keywords]hepatoma/immunology; antigen; neoplasm/genetics; epitope; heat?shock protein 70/genetics; gene expression

原发性肝癌是严重危害我国人民身体健康的恶性疾病之一。近几十年来, 尽管诊疗手段有了很大的进步, 但肝癌的预后并没有得到显著改善。生物治疗是肝癌治疗的重要手段之一, 尤其可能在复发转移的控制中发挥重要作用。我们应用弱酸洗脱?质谱法首次从肝癌细胞系中成功分离了mage?1编码的由hla?b7提呈的肝癌抗原肽epvtkaeml, 将其负载dc细胞, 在体外及裸鼠体内均可诱导抗肝癌特异性免疫反应[1, 2]。为加强epvtkaeml的免疫原性, 选择具有诱导抗肿瘤免疫作用的hsp70为载体, 制备了epvtkaeml与hsp70的融合蛋白, 为进一步观察融合蛋白能否诱导产生肝癌抗原肽特异性ctl, 寻求更有效的抗肝癌抗原肽疫苗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 菌种e.coli bl21(de3)由本室保存。原核表达载体pet?28a(+)、 含hsp70基因全长片段的质粒 pcdna3.1(+)/hsp70 (本校病理学教研室惠赠), b型质粒小样快速提取试剂盒和b型小量dna片段快速胶回收试剂盒(北京博大泰克公司), pyrobest dna聚合酶、 t4连接酶、 限制性内切酶(takara公司)。

1.2 方法

1.2.1 用加端pcr方法构建epvtkaeml与hsp70的融合基因 根据hsp70基因的核苷酸序列, 结合引物设计的原则, 设计引物, 在下游引物的5′端加入epvtkaeml的核苷酸序列(共27个碱基), 并在引物两端分别加入bamh i及xho i酶切位点, 引物在上海生工生物工程技术有限公司合成。上游引物: 5′?cgg gat cca tgg cca aag ccg cgg cg?3′, 下游引物: 5′?cga ctc gag tta cag cat ttc agc ttt ggt aac cgg ttc atc tac ctc ctc aat ggt ggg?3′。此序列中2处下划线部分分别为bamh i和xho i, 黑体（加粗）部分是肝癌抗原肽epvtkaeml。反应条件为: 94℃预变性5 min, 94℃ 变性1 min, 58℃退火50 s, 72℃延伸3 min, 循环1次; 94℃变性1 min, 68℃退火及延伸3 min, 循环28次, 另加72℃延伸7 min, pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳, 回收。

1.2.2 重组质粒pet?28a(+)/epvtkaeml?hsp70的构建 用bamh i和ecor i双酶切pcr扩增的融合基因epvtkaeml?hsp70和表达载体pet?28a(+), 进行琼脂糖凝胶电泳。分别回收目的片段和表达载体, 以t4 dna连接酶于16℃连接16 h, 转化感受态e.coli bl21(de3)。卡那平板筛选阳性克隆。提取阳性克隆菌质粒, 以bamh i和ecor i酶切和dna序列分析鉴定阳性克隆。

1.2.3 融合基因epvtkaeml?hsp70的诱导表达 将含pet?28a(+)/epvtkaeml?hsp70质粒的e.coli bl21(de3)接种于5 ml含100 mg/l卡那霉素的lb培养液中, 37℃震荡培养至a≈0.5, 加入iptg至终浓度0.5 mmol/l, 继续培养3 h取出, 离心收菌, 加入sds?page上样缓冲液, 混匀, 煮沸5 min, 12000 r/min离心10 min, 取上清做sds?page, 考马斯亮蓝r250染色。

2 结果

2.1 肝癌抗原肽与hsp70融合基因的构建 以pcdna3.1(+)/hsp70质粒为模板, 在下游引物的5′末端引入27个碱基的模拟表位基因, 经加端pcr使epvtkaeml与hsp70的序列连接起来, 获得了2.0 kb的融合基因, 与预期片段的大小一致。

图1 epvtkaeml?hsp70融合基因pcr结果的琼脂糖凝胶电泳（略）

fig 1 agarose gel electrophoresis of epvtkaeml?hsp70 fusion gene pcr product

m: dna marker; 1: epvtkaeml?hsp70 (2.0 kb).

2.2 融合基因的序列分析 pcr构建的融合基因克隆到pet?28a(+)载体上, 选取1株酶切鉴定正确的克隆, 用双脱氧终止法测定序列。序列分析的结果表明, 肝癌抗原肽基因序列已连接于hsp70的3′末端, hsp70序列与基因库中的一致。在hsp70的5′端有起始码, 抗原肽基因序列的3′端有终止码。

2.3 原核表达载体pet?28a(+)/epvtkaeml?hsp70的鉴定 用bamhi、 xhoi从pet?28a(+)载体上消化释放出2.0kb大小的片段(图2)。

图2 pet?28a(+)/epvtkaeml?hsp70重组质粒的酶切鉴定（略）

fig 2 identification of recombinant pet?28a(+)/epvtkaeml?hsp70

m: dna marker; 1: pet?28a(+)/epvtkaeml?hsp70 digested by bamh i and xho i.

2.4 融合基因在大肠杆菌中的表达 重组的表达载体pet?28a(+)/epvtkaeml?hsp70在bl21(de3)菌中经iptg诱导表达, sds?page(图3)显示经iptg诱导的重组载体在mr 72000有表达明显增多的蛋白条带, 与预期大小一致, 未经诱导的重组载体未见此现象。

图3 原核表达epvtkaeml?hsp70融合蛋白sds?page电泳分析（略）

fig 3 analysis of prokaryotic expression epvtkaeml?hsp70 by sds?page

m: protein marker; 1: the split supernatant of pet?28a(+)/epvtkaeml?hsp70 bacterial before iptg induction; 2: the split supernatant of pet?28a(+)/epvtkaeml?hsp70 bacterial after iptg induction.

3 讨论

随着对抗原加工和提呈过程的了解, 人们发现t细胞识别抗原实际上只是识别一段能与mhc分子相结合的多肽[3]。因而如果用相应多肽作为肿瘤疫苗就能够直接引起机体t细胞的反应。目前许多能被t细胞识别的肿瘤抗原多肽已确定, 这也使得用多肽作为肿瘤疫苗成为可能。最早进入临床试验的多肽疫苗是用于黑色素瘤的多肽疫苗, 在接受治疗的患者中大约10%～30%会有一定的效果[4]。rosenberg等[5]在一项研究中证实, 用黑色素瘤分化抗原gpl00的多肽疫苗和白细胞介素2(il?2)免疫16名黑色素瘤患者, 其中6名(38%)出现了肿瘤的缩小。陈红松等[6]研究发现, 肿瘤抗原ny?eso?1b多肽疫苗能够成功诱导部分中国肝癌患者特异的、 显著的抗肝癌免疫应答, 有效杀伤手术后残留的癌细胞, 降低手术后肝癌的转移和复发, 可能是一种有效的肝癌辅助治疗手段。肿瘤抗原ny?eso?1b多肽疫苗已经获得国家食品药品监督管理局批准进行ⅰ期临床试验。

肿瘤肽疫苗的明显缺点是免疫原性太弱, 研究发现, hsp70可以在体外以非共价键的形式与多肽表位结合, 形成hsp70?肽复合物, 也可以采用基因定点克隆的方法, 使多肽通过共价键结合于hsp70, 可更有效地激活t细胞, 极大地增强辅t细胞的功能, 从而提高表位疫苗的免疫效能。这两种方法均可激活cd8+t细胞, 产生多肽特异性的ctl反应, 而后者因不受肿瘤标本量的限制, 实用性更强[7]。本研究我们采用加端pcr方法将肝癌抗原肽epvtkaeml的cdna序列简便、 快捷的融合到hsp70的3′末端, 经酶切鉴定及测序证实, 融合基因构建成功, 抗原肽epvtkaeml与hsp70基因的开放读框正确, 并在大肠杆菌中表达出与预期mr大小一致的蛋白, 该表达产物可用于抗肝癌多肽疫苗的研究。

【参考文献】

[1] 郭爱林, 隋延仿, 叶 菁, 等. 一个新的mage?1表位为肝癌细胞表面hla?b7分子递呈[j].