RP-HPLC测定无刺枸骨不同部位中齐墩果酸和熊果酸的含量

关键词 无刺枸骨 齐墩果酸 熊果酸 反相高效液相色谱法 光电二极管阵列检测器

枸骨(Ilex cornuta Lindl.ex Paxt.)是冬青科冬青属植物,又名猫儿刺、鸟不宿。枸骨在我国分布较广,长江中下游各省皆有分布,其叶呈小角刺状,枝、叶、木、皮皆入药,有补肝肾、养气血、祛风湿、滋阴、益精、活络的功能[1]。传统中医药理论认为,枸骨叶具有清热养阴,平肝益肾,散风通络等功效,用于肺痨咯血,骨蒸潮热,头晕目眩,高血压等症[2]。枸骨中富含的齐墩果酸(OA)和熊果酸(UA)等三萜酸类成分[3],具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血糖血脂等多种生理作用,已引起人们广泛的兴趣和关注[4-5]。无刺枸骨(Ilex Cornuta Var.fortunei)是冬青属枸骨的自然变种,常绿灌木或小乔木,其枝叶稠密,叶深绿光亮,入秋红果累累,经冬不凋,鲜艳美丽,是良好的观叶、观果树种[6],但无刺枸骨的化学成分研究尚未见文献报道。本实验采用超声辅助提取,建立反相高效液相色谱法同时测定了无刺枸骨不同部位中齐墩果酸和熊果酸的含量,旨在为无刺枸骨的质量控制及其开发利用提供科学依据。

1 仪器与试剂

Waters高效液相色谱仪(美国Waters公司,515泵,2996光电二极管阵列检测器,7725i进样阀,Empower中文色谱数据工作站);RO-MB-10D高纯水机(杭州永洁达膜分离设备厂);CP225D电子分析天平(北京塞多利斯天平有限公司);SK2510HP超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。甲醇为色谱纯(江苏汉邦科技有限公司);齐墩果酸、熊果酸对照品(中国药品生物制品检定所提供,批号分别为:110709-200311,110742-200314);无刺枸骨样品采自江西省宜春市,经鉴定为冬青科冬青属植物Ilex Corunta Var.fortunei。

2 方法与结果

2.1 色谱条件:色谱柱为Kromasil C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相为甲醇-水-磷酸(90∶10∶0.2,v/v/v);流速0.8mL•min-1;检测波长210nm;柱温为25℃。以齐墩果酸和熊果酸计,理论塔板数均大于12000,齐墩果酸和熊果酸分离度大于1.8,对称因子分别为1.02、1.01,外标法定量分析。对照品和样品色谱见图1。

2.2 溶液配制:分述如下。

2.2.1 对照品溶液:分别精密称定齐墩果酸、熊果酸对照品2.75mg、5.10mg,置于10mL量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,制成含齐墩果酸0.275mg•mL-1和熊果酸0.510mg•mL-1的对照品混合贮备液。

2.2.2 样品溶液:取于60℃干燥并粉碎过20目筛的无刺枸骨各部位原料药粉末约1~5g,分别置于50mL具塞锥形瓶中,用95%乙醇50mL超声提取45min,放冷,再称定质量,用乙醇补足减失的质量,摇匀,用0.45滤膜过滤即得。

2.3 峰纯度检测:当纯度角小于阈值时,在测量的噪音内光谱是均匀的,为纯组分;当纯度角大于阈值时,表示有共流出物存在。使用二极管阵列检测器在190-400nm波长范围内采集组分峰的3D图谱,峰纯度分析条件为:检测波长190~400nm,最小分辨率1.2nm,峰宽30s,基线噪音阈值50μV•s,噪音间隔起止时间0.25~0.75min。结果表明,对照品和样品溶液中齐墩果酸和熊果酸的紫外光谱一致,最大吸收波长均为202.2nm。纯度图中齐墩果酸和熊果酸峰的纯度线位于自动阈值线下方,纯度角均小于阈值,表明齐墩果酸和熊果酸色谱峰均为单一组分吸收峰,无其它组分的干扰。

2.4 线性关系试验:精密吸取齐墩果酸和熊果酸对照品混合贮备液中2、6、10、15、20μL进样分析,按色谱条件测定峰面积,以对照品的进样量为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,得齐墩果酸回归方程为:Y=4.27×105X-2.84×104(r=0.9999),熊果酸回归方程为:Y=4.55×105X-1.74×104(r=0.9999)。表明齐墩果酸进样量在0.55～5.50μg;熊果酸进样量在1.02～10.20μg时,线性关系良好。

2.5 精密度试验:分别精密吸取对照品混合贮备溶液10μL,平行进样5次,以峰面积计算色谱系统精密度,齐墩果酸和熊果酸峰面积RSD分别为0.6%(n=5)和0.3%(n=5)。进样方法和仪器精密度良好。

2.6 重现性试验:取无刺枸骨叶样品5份,按样品溶液制备方法制备样品溶液。精密吸取各样品溶液10μL,进样,测定其峰面积积分值,外标法计算含量,齐墩果酸和熊果酸含量的RSD分别为2.1%(n=5)和1.8%(n=5)。结果表明方法重现性良好。

2.7 加样回收率试验:精密称取已知齐墩果酸和熊果酸含量的无刺枸骨叶样品6份,按高、中、低三种浓度分别加入对照品适量,制备样品溶液,进样测定含量,齐墩果酸平均回收率为99.2%,RSD为1.5%(n=6);熊果酸平均回收率为97.8%,RSD为1.2%(n=6)。

2.8 样品含量测定:精密吸取制备的样品溶液各10μL进样,测定齐墩果酸和熊果酸峰面积积分值,外标法计算齐墩果酸和熊果酸的含量。测定结果见表1。

3 讨论

测定结果表明,在无刺枸骨不同部位中,叶中的齐墩果酸和熊果酸含量均明显高于其他部位,而叶又以嫩叶中2组分的含量最高。无刺枸骨不同部位的齐墩果酸和熊果酸含量顺序均为:嫩叶>叶>枝>果实,同一部位中熊果酸含量均远高于齐墩果酸含量,可作为提取分离熊果酸的优良原料。

二极管阵列检测器可以同时在设定波长区域内的各波长下进行立体数据采集,既可以察看各波长下的色谱图又可以察看各时间下的光谱图,在比对保留时间的基础之上,加以光谱确认,可以克服仅以保留时间一项指标定性的缺点,增强了定性的确定性。此外,二极管阵列检测器与Empower色谱工作站系统适应性软件联用,可分析组分色谱峰峰纯度,进一步增强色谱方法的定性能力。

齐墩果酸和熊果酸互为同分异构体,结构与极性均极其相似,在天然植物中往往共生互存,分离测定较为困难。本试验建立的反向高效液相色谱法,可同时测定无刺枸骨不同部位中齐墩果酸和熊果酸的含量,由于样品处理简单,分离效果好,所以待测组分无其它杂质的干扰。

4 参考文献

[1]杨卫华,赵玉丛.中药枸骨叶化学成分和药理作用的研究进展[J].医药世界,2007(3):103.

[2]江苏新医学院,中药大词典(下册)[M].上海:上海科学技术出版社,1986:1521.

[3]姚志容,李军,周思祥,等.枸骨叶中的三萜类成分[J].中国中药杂志,2009,34(8):999.

[4]李开泉,陈武,熊筱娟,等.乌索酸的化学、药理及临床应用进展[J].中成药,2002,24(9):709-711.

[5]张奕颖,邓涛,胡志芳,等.熊果酸体外抗胃癌细胞SGC7901机制的研究[J].中草药,2006,37(4):555.

[6]周财金.优良的观叶赏果树种――无刺枸骨[J].中国花卉盆景,2007(11):33.

收稿日期 2009-11-18