酶法测定不同产地白术中的多糖含量

摘要 目的:分析测定浙江、贵州、湖南等地白术的多糖含量。方法:分别用水煎煮提取和乙醇回流提取白术多糖,用酶法在505nm波长处用分光光度法测定水溶性糖和还原性糖的含量。结果:水溶性多糖平均回收率为101.1%,RSD=1.38%;还原性多糖平均回收率为100.5%,RSD=2.19%。贵州余庆的多糖含量最高,浙江3个品种次之,含量稳定。结论:所用方法简便、快速、准确,可用于不同产地白术的含量比较。

关键词 白术 多糖 酶法 分光光度法

白术是传统中药,《中国药典》收载的白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎。性苦、甘、温,归脾、胃经。具健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎之功效[1],为中医临床传统用药,是卫生部审定的预防“非典”参考中药处方中所用药材之一。全国各地均有出产,但是研究报道以浙江、安徽、四川等地的品质为优。白术中含有多糖、苍术酮、苍术醇、白术内酯、含氧香豆素类、氨基酸及树脂等成分,白术多糖在抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、降血糖等方面的作用已由大量研究实验结果证实,白术多糖的免疫调节功能及降血糖作用也有报道[2-4]。由于白术分布广泛,生长地不同,除野生品外,还有引种、栽种品。因生长地域的不同,药材中活性成分的含量不同[5],建立白术中主要成分的含量测定方法并进行含量比较,是评价药材质量的重要手段。本文对不同产地的白术多糖进行含量测定,以比较多糖含量,并结合其他指标成分,进行优质种源的筛选。

1 仪器与试药

1.1 仪器:岛津UV―2450紫外―可见光分光光度计(日本岛津);METELLER电子分析天平(瑞士梅特勒);中药粉碎机(上海淀久)。

1.2 试剂:药用乙醇(杭州余杭华绿日用化工有限公司),葡萄糖试剂盒(YZB/浙 1646-2007,宁波赛克生物科技有限公司),氯仿和正丁醇(分析纯,临海市浙东特种试剂公司),蒸馏水为反渗透纯水。

1.3 药材:不同产地药材采自全国各产区,经高家鉴主任中药师鉴定均为正品,见表一。

2 方法与结果

2.1 水溶性糖的制备:取不同产地白术粗粉10g,置圆底烧瓶中,分别加水100ml,煮2h,滤过,然后在滤渣中加水75mL,煮沸30min,滤过,合并两次滤液,水浴浓缩至30mL,加3倍95%乙醇振摇离心,再用75%乙醇冲洗,离心,反复3次,去溶液取沉淀。加水溶解,用氯仿:正丁醇(5∶1)沉淀分4次去除蛋白,萃取振摇静置后分离,至至氯仿层无沉淀产生,分取除蛋白后的水溶液,滤过,溶液转移至200mL容量瓶中,加水到刻度,摇匀,得到水溶性糖供试品溶液,冷藏保存备用[6-7]。

2.2 还原性糖的制备:取不同产地白术精粉10g,置圆底烧瓶中,分别加乙醇150mL,放至85℃水浴中,回流提取1小时,过滤,滤渣中续加乙醇液150mL,同法提取两次,合并3次滤液,水浴蒸发至无醇味,溶液转移至200mL容量瓶中,加水洗涤蒸发皿2次,并将洗涤液并入容量瓶中,加水至刻度,摇匀,得到还原性糖供试品溶液,冷藏保存备用。

2.3 线性关系考察:精密量取浓度为999μg•mL-1的葡萄糖校准液100μL、200μL、300μL、400μL、500μL和600μL,置6个干燥洁净试管中,再分别精密加入苯甲酸钠饱和水溶液900μL、800μL、700μL、600μL、500μL和400μL,震荡混匀。然后各取上述溶液0.1ml,置另6支试管中,另取一个试管为空白管,加纯水0.1mL,各试管中分别精密加入试剂R12.7mL及R20.3mL,混匀,37℃水浴放置30分钟。在505nm处以(水)空白管调零,测定各个浓度溶液吸收度。以葡萄糖含量(μg•mL-1)为横坐标,吸收度为纵坐标,计算得回归方程:A=1.1971C+0.1468(r=0.997),其在3.23-19.35μg•mL-1浓度范围内呈良好线性关系。

2.4 样品含量测定:水溶性糖溶液与还原性糖溶液临用前经0.45μm孔径的微孔滤膜过滤,取各个样品滤液各100μL,按照2.3操作。在505nm处以(水)空白管调零,测定各个样1溶液吸收度。以6.45μg•mL-1的葡萄糖溶液为标准,外标一点法计算含量,结果见表1。

2.5 回收率实验:①取贵州余庆样品水溶性多糖溶液0.05mL,精密加入葡萄糖标准液(n=5),按2.3中制备方法处理,以水溶液加试剂为空白,测定吸收度,计算回收率,平均回收率101.1%,RSD=1.38%。②取贵州余庆样品还原性多糖溶液0.05mL,精密加入葡萄糖标准液(n=5),按2.3中制备方法处理,以水溶液加试剂为空白,测定吸收度,计算回收率,平均回收率为100.5%,RSD=2.19%。

2.6 稳定性试验:取贵州余庆供试品溶液,于10h内每隔1h测定吸收度。结果水溶性糖与还原性糖供试品溶液均在4h内稳定,RSD分别为1.93%,2.06%。

2.7 分析结果:10个不同产地的白术样品,其水溶性多糖含量均高于还原性多糖,提示了白术中多糖的组成与理化特性。水溶性多糖含量最高的为贵州余庆产白术,其次为浙产白术,产地为天台、临安及磐安的含量相当,说明浙产白术含量稳定;水溶性糖含量最高的为浙江临安产白术,贵州余庆及松桃的次之。若以总多糖计,含量最高的为贵州余庆,其次为浙江临安和磐安的白术。

3 结论与讨论

水溶性多糖提取过程中,蛋白质的去除直接影响测定结果,因此蛋白沉淀剂的选择及操作程序需要经过比较试验,最终选择文中的方法。

酶法测定原理为葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下,生成葡萄糖酸,在过氧化物酶的作用下与4-氨基安替比林和酚生成醌亚胺,方法灵明度高,操作简单。试验中发现供试品溶液经过滤去除大颗料能够显著加快显色时间,并且水浴加热时间对显色反应影响较大,最终确定过滤,水浴30分钟的显色方案。

以多糖含量为指标,10个产品中贵州余庆及浙产3个品种品质较好,结果与作者以其他成分为指标得出的结论基本一致。但有部分不完全符合,说明了药材组分整体评价的重要性。

4 参考文献

[1]国家药典委员会.中国药典一部[M].北京:化学工业出版社,2005:68.

[2]季宇彬,高世勇.多糖的研究进展[J].中草药,2003,34(增刊):45-53.

[3]汤新江.白术多糖对小鼠免疫功能的影响[J].中医研究,1998,11(2):7-9.

[4]单俊杰,田庚元.白术多糖复合物AMP-B的理化性质及降血糖活性研究[J].药学学报,2003,6(6):38.

[5]寿旦,戴诗文,章建民,等.白术微管液相色谱含量测定方法及在种质资源调查中的应用[J].中华中医药学刊,2009,27(1):61-62.

[6]邱细敏,唐小异,刘胜姿,等.白术多糖葡萄糖的含量测定[J].湖南师范大学学报(医学版),2004,1(1):47-49.

[7]邱细敏,卢岳华,沈品,等。不同产地白术多糖含量测定[J].中国药业,2005,14(4):40-41.

收稿日期 2009-10-28