复合氰基丙烯酸酯—骨形态发生蛋白生物胶预防大鼠牙槽嵴萎缩的实验

[摘要] 目的 制备复合氰基丙烯酸酯-骨形态发生蛋白（bmp）生物胶，并植入大鼠拔牙窝观察其预防牙槽嵴萎缩的效果。方法 选用wistar大鼠54只，随机分为3组：实验组（复合氰基丙烯酸酯-bmp生物胶组）、对照组（壳聚糖温敏性胶体组）、空白对照组。拔除大鼠下颌切牙后，实验组和对照组在牙槽窝内即刻植入复合氰基丙烯酸酯-bmp生物胶、单纯壳聚糖温敏性胶体，空白对照组则不植入任何材料。3组动物在植入后3、6、9周处死，分离切取下颌骨，用高频钼靶扫描仪获得图像信息，使用image-pro plus软件处理图像，得到剩余牙槽嵴相对高度和牙槽窝相对光密度，组织学观察牙槽窝内的成骨情况。结果 术后3、6、9周，实验组的剩余牙槽嵴相对高度和牙槽窝相对光密度均高于对照组和空白对照组（p<0.05）；组织学观察显示实验组牙槽窝成骨多于对照组和空白对照组。

结论 复合氰基丙烯酸酯-bmp生物胶可以用于预防拔牙术后剩余牙槽嵴萎缩，其临床应用前景广阔。

[关键词] 骨形态发生蛋白； 氰基丙烯酸酯； 壳聚糖； 牙槽嵴萎缩

[中图分类号] r 318.08 [文献标志码] a [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.006

牙齿拔除后牙槽嵴呈失用性、进行性萎缩，给以后的种植体植入和常规义齿（尤其是全口义齿）修复带来了极大的困难。42%的全口义齿修复不良都是牙槽嵴萎缩导致的义齿固位不好和咀嚼功能欠佳[1]。预防牙拔除术后牙槽嵴萎缩的研究一直是国内外研究的热门课题[2-3]。本研究以氰基丙烯酸正丁酯、壳聚糖为载体，加入重组人骨形态发生蛋白（recombi-nant human bone morphogenetic protein，rhbmp）制备成生物胶体复合氰基丙烯酸酯-骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，bmp）生物胶，在大鼠牙拔除术后即刻植入牙槽窝内，利用复合物的温敏性效应和氰基丙烯酸正丁酯的聚合作用，达到固化、止血、消炎、诱导牙槽窝新骨形成的目的，从而预防牙槽嵴的萎缩[4-7]，为今后复合胶体在临床的应用

提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 54只6～8周龄清洁级wistar大鼠，雌雄各半，体重180～200 g，由总医院动物实验中心提供。分笼饲养（5～6只/笼），饲养温度（22±2） ℃，每日光照12 h，自由饮水，静养1周。

1.1.2 试剂及仪器 rhbmp（bbi公司，加拿大），β-

甘油磷酸钠（sigma公司，美国），氰基丙烯酸正丁酯（北京瞬康科技发展有限公司），壳聚糖（青岛海汇生

物有限公司），磁力搅拌机（上海大中分析仪器厂），水浴箱（巩义市予华仪器有限责任公司），高频钼靶扫描仪（planmed sophie公司，芬兰）。

1.2 复合氰基丙烯酸酯-bmp生物胶及壳聚糖温敏

性胶体的制备

复合氰基丙烯酸酯-bmp生物胶的制备[4，8]：将壳

聚糖溶解于浓度为16 mol·l-1的乙酸溶液中，在磁力搅拌器下按1∶1的比例逐滴加入到1.30 mol·l-1 β-甘油磷酸钠溶液中，再持续搅拌0.5 h，制备成温敏性胶体。在此基础上使用95%盐酸溶液将已经准备好的温敏性胶体调至ph值3.5，边搅拌边滴加适量氰基丙烯酸正丁酯，所得溶液中加入rhbmp使终溶液中rhbmp为100 μg·l-1，磁力搅拌器常温下持续搅拌

3 h，密封后4 ℃冰箱保存备用。制备物最终状态为白色胶体，半流动。

壳聚糖温敏性胶体的制备：方法同复合氰基丙烯酸酯-bmp生物胶，止于温敏性胶体的制备，不放入rhbmp及氰基丙烯酸正丁酯。

1.3 动物分组及手术

54只wistar大鼠随机分为3组：实验组（复合氰基丙烯酸酯-bmp生物胶组）、对照组（壳聚糖温敏性胶

体组）、空白对照组，每组18只，雌雄各半。

在吴哲等[9]建立大鼠剩余牙槽嵴吸收模型的基

础上加以改进，分别于拔牙前12、9、6 d，麻醉大鼠（10%水合氯醛，腹腔注射，300 mg·kg-1），使用

持针器齐牙龈处夹断左侧中切牙牙冠造成冠折，用探针或细针向牙髓方向伸入，使牙髓损坏加剧。拔除牙齿时，自制探针分离牙龈，用持针器沿近远中方向夹持，顺牙冠根方向完整脱位。牙拔除后，即刻将氰基丙烯酸正丁酯-bmp生物复合胶、壳聚糖温敏性胶体，使用注射器（针头呈一定曲度弯曲，与牙

长轴平行）分别送入实验组和对照组的牙槽窝。空

白对照组不放入任何材料，牙槽窝血液自行填满，凝固。

后5 d，每日腹腔注射庆大霉素（10万u/只）预防感染。

1.4 标本分离并检测

各组大鼠分别于术后3、6、9周使用中性甲醛行心脏灌注处死，每次6只。将左右下颌骨完整分离，分离标本置于中性甲醛固定24 h。

1.4.1 牙槽嵴高度和牙槽窝光密度测定 将固定后的标本用高频钼靶扫描仪摄取软x线片[10]，投照条件为电流30 ma，电压20 kv，曝光时间0.4 s，标本舌侧朝上放置，保持颊侧牙槽嵴顶与胶片平行。

使用image-pro plus软件测定分析剩余牙槽嵴高度和牙槽窝光密度。1）剩余牙槽嵴高度：分别测定各个动物拔牙侧和非拔牙侧下颌第一磨牙牙槽骨最高点到舌侧下牙槽突最前上点之间的距离，计算二者比值，得出剩余牙槽嵴相对高度（图1）。2）牙槽窝

光密度：分析软x线片，分别测定各个动物拔牙侧牙槽窝光密度与未拔牙侧牙槽窝光密度，计算二者比值，得出牙槽窝相对光密度。

上：未拔牙侧；下：拔牙侧；ab：切牙牙槽嵴的高度；cd：拔牙侧牙槽嵴的高度。

图 1 拔牙侧与非拔牙侧剩余牙槽嵴高度 　fig 1 the length of residual alveolar ridge of extracted side and

non-extracted side

1.4.2 组织学观察 中性甲醛固定离体下颌骨24 h，硝酸（4%甲醛、8%硝酸、0.1%尿素）脱钙，常规乙醇脱水，石蜡包埋。4 μm切片，苏木素-伊红染色，倒置显微镜下观察牙槽窝内的成骨情况。

1.5 统计学分析

采用spss 17.0统计软件对计量资料进行方差分析。

2 结果

2.1 大体观察

牙拔除术后即刻放入材料，可见对照组出血少，胶体凝固较快，实验组次之，而空白对照组出血时间较长，需要待血凝块形成。

所有伤口均为ⅰ期愈合，无1例感染或排异反应。

术后3周可见3组标本无明显差异，但空白对照组有肉芽组织增生；术后6、9周3组标本可以看到明显的差别，空白对照组骨吸收最明显，其次为对照组，实验组骨吸收最少。实验组和对照组中均可见到残余的材料。

2.2 软x线片观察

软x线片可见：术后空白对照组牙槽嵴顶水平吸收，形态较差，牙槽嵴高度明显降低；实验组的牙槽嵴吸收较少，牙槽嵴形态好，牙槽窝内x线密度较高，高度降低不明显；对照组介于二者之间（图2）。

2.3 剩余牙槽嵴的相对高度

3组术后剩余牙槽嵴的相对高度见表1。从表1可见：术后3周，实验组及对照组剩余牙槽嵴相对高度高于空白对照组，实验组高于对照组（p<0.05）；第

6周，实验组及对照组牙槽嵴相对高度明显高于空白对照组，实验组与对照组的差别也较明显（p<0.05）；第9周，3组差异性更加明显，与对照组及空白对照组相比，实验组牙槽嵴相对高度明显较大，吸收明显减少（p<0.05），对照组与空白对照组间的差异较

小，但具有统计学意义（p<0.05）。

2.4 牙槽窝相对光密度

3组术后牙槽窝的相对光密度见表2。从表2可见：术后3、6周，实验组的相对光密度值略高于对照组及空白对照组（p<0.05），对照组略高于空白对

照组（p<0.05）；术后9周，实验组相对光密度明显高于对照组及空白对照组（p<0.05）。

2.5 牙槽窝内成骨的组织学观察

3组术后牙槽窝内成骨的组织学观察见图3。术后3周，空白对照组可见少量毛细血管长入，但仍可见明显的出血及炎性细胞，成骨少见，纤维生长明

显；对照组及实验组可见毛细血管较多，有少量骨组织生成，实验组炎性细胞最少，骨组织最多（图3）。术后6周，实验组骨组织新生明显，对照组骨组织较少，存在纤维组织，空白对照组纤维组织较多；术后9周，差异性更加明显，实验组及对照组有大量的新生骨组织，空白对照组新生骨组织最少。

3 讨论

牙槽骨作为牙齿的支持组织，与牙齿有着密切的关系。牙齿的缺失会引起牙槽骨呈不可逆、持续性的吸收萎缩，而牙槽骨萎缩又可以间接影响相邻牙齿的健康，从而牙槽骨萎缩呈进行性加剧。牙槽骨萎缩不可避免地使原有牙槽嵴高度及宽度丧失，这给今后常规义齿的修复以及种植牙的植入带来困难，严重着无法进行义齿的修复。预防牙槽嵴高度的缺失仍然是今后研究的重点之一。

根据block等[3]的分类将牙槽嵴的增高分为相对

增高法和绝对增高法，这两种方法都需通过手术得以实施。前者是改变周围解剖结构，相对地增高牙槽嵴高度。后者

很大程度上依赖所需材料的性质，通常植入材料有异种骨、异体骨、自体骨、人工骨材料及组织工程骨等，但自体骨会给患者带来二次创伤，异体骨、异种骨存在严重的免疫排斥反应，人工骨材料则价格较昂贵，组织工程骨不够成熟，仍处在初期研究阶段。这就需要一种材料来作人工骨材料和组织工程骨之间的过渡，即复合型的骨诱导材料[2，11]。

bmp具有较强的诱导成骨作用，其中rhbmp-2成骨作用最强[12]。在以往的研究中，往往骨形态发

生蛋白在骨缺损部位初始时达到了所需要的浓度，但后期由于吸收的速率比较快及受到炎性反应的影响，其作用受到了限制[13-15]。壳聚糖[16]为天然多糖，在临床上是一种较好的载体材料，具有无免疫原性、无刺激性、无毒性、无致突变、无热原反应及致死性突变效应等特性，多用于缓释、抑菌、止血、抗肿瘤等[17]方面，但作为支架材料单独使用存在降解快、承重不佳等缺点。α-氰基丙烯酸酯系早在1955年就被合成[18]，以后作为软组织医用胶在临床上沿用至

今。但其作为载体的应用，也就是在纳米技术兴起之后，多用于制备载药纳米微粒[19]。然而氰基丙烯

酸酯单体在阴离子存在的情况下，微量水、醇或者弱碱的作用均会迅速激发单体阴离子的聚合，聚合

后的物质具有性质稳定和更强的局部止血功能，并且凝固后还有一定的强度并能适应牙槽窝的形状。本实验应用的就是该体系中的α-氰基丙烯酸正丁酯。

本研究在壳聚糖温敏性胶体的基础上加入了rhbmp-2、α-氰基丙烯酸正丁酯制成复合生物制剂，制备的材料初始呈液体状，有一定的黏性，流动性较佳，在遇到周围温度变化时可以出现凝固的状态，利用这种性质，将药物低温储存于注射器中，使用时将其注射入牙槽窝，待其改变性状发挥作用，使用方便快捷。利用α-氰基丙烯酸正丁酯呈微球、遇羟基可以聚合以及在人体温度下胶体能够聚合的特点，在牙拔除术后植入牙槽窝以起到止血、诱导骨形成、承重、提供足够骨生长空间等作用。从本实验可以看出，术后3周是牙槽骨高度丧失的高峰时期，此后牙槽骨丧失渐渐趋于稳定，9周时达到稳定期。术后3、6、9周，实验组、对照组的牙槽嵴相对高度和牙槽窝光密度均大于空白对照组（p<0.05）。由于

壳聚糖也具有成骨作用，所以在不同时期对照组牙槽嵴相对高度和牙槽窝光密度也高于空白对照组。组织学观察表明：术后3周时空白对照组大鼠牙槽窝内可以看到明显的出血及炎性细胞浸润，实验组炎性细胞最少，骨组织最多。这可能是由于氰基丙烯酸酯遇羟基后发生聚合，作为一种空间占用物阻碍并减少了炎性细胞的扩散，在缓慢的骨生长过程中，聚合后的物质存在一定的孔隙，在其降解过程中，成骨细胞也伴随爬行长入，最终骨组织代替聚合物，新骨生成，但在病理切片中未能看到实验材料的存在，可能是由于材料性状所决定，在制片过程中破坏脱落，仅见少量小裂隙。术后6周，实验组骨组织新生明显，对照组骨组织较少，存在纤维组织，空白对照组纤维组织较多；术后9周，差异性更加明显，实验组及对照组有大量的新生骨组织，空白对照组新生骨组织最少，此时牙槽嵴的吸收也趋于稳定。由此可见，复合氰基丙烯酸酯-bmp生物胶可加快牙槽窝的愈合及骨化，从而预防剩余牙槽骨的吸收，在今后的临床应用中前景比较广阔。bmp虽然有较强的骨诱导作用，但局部作用范围内所持续的时间以及作用时间内能达到骨诱导能力所需的浓度，是值得继续思考的。氰基丙烯酸酯的性质决定了材料的储存时间并不长及在室温条件下放置时间不能过久等特点，这些都需要进一步的探讨研究。

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