黄瓜内生枯草芽孢杆菌B10抗菌活性物质稳定性研究

摘 要：为了明确枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B10抗菌活性物质的稳定性，采用平板对峙培养法研究了温度、紫外线、蛋白酶和pH值对其活性的影响。结果表明，高温和过度酸碱均对其抑菌活性有一定影响，蛋白酶和紫外线照射对其生防活性没有明显的影响。

关键词：枯草芽孢杆菌；抗菌活性；黄瓜

中图分类号：S642.2 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.04.002

Investigation on Stability of Antagonistic Substance from Endophytic Bacillus subtilis B10 in Cucumber

YUE Dong-xia, ZHANG Yao-wu, LIU Yu-feng

(Tianjin Research Center for Agricultural Biotechnology, Tianjin 300192,China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ: The stability of antagonistic substance of endophytic Bacillus subtilis strain B10 to temperature, UV, protease and pH was studied by face to face culturing method, the results showed that antibiotic activity of aseptic filtration was effected by high temperature and excessive pH, but it wasn’t effected by protease and UV.

Key words: Bacillus subtilis; antibiotic activity; cucumber

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在植物病害生物防治中所起的作用越来越受到人们的关注[1-4]。其不仅对多种植物叶部和果实病害如白粉病、灰霉病、霜霉病和黑穗病等有较好的防治效果[5-9]，对多种土传病害如枯萎病、根腐病等也起到一定的抑制作用[10-12]。枯草芽孢杆菌的生防作用机制主要包括竞争作用、诱导抗性作用、促生作用和拮抗作用[13]。拮抗作用一直是人们研究的热点，产生的抗菌活性物质主要包括脂肽类抗生素和蛋白类抗菌活性物质[10]。笔者从黄瓜植株体内分离到一株内生枯草芽孢杆菌B10，对番茄早疫病、黄瓜枯萎病菌和黄瓜灰霉病菌均有较好的拮抗作用。本试验以番茄早疫病病原真菌为目标菌株，对该枯草芽孢杆菌分泌的抗菌活性物质的稳定性进行了研究，为其进一步应用提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 抗菌活性物质的获得

将Bacillus subtilis B10接种于LB培养基中，30 ℃、150 rpm·min-1振荡培养24 h，6 000 g 离心10 min收集上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，将无菌过滤液置于4 ℃冰箱备用。

1.2 抗菌活性物质对番茄早疫病菌的拮抗作用

采用对峙培养法。将番茄早疫病菌接种于PDA培养基上，25 ℃、黑暗培养5 d后，用Ф=4.5 mm的打孔器打取菌落边缘菌丝块备用。在Ф=90 mm的培养皿中倒入PDA培养基，在培养皿边缘放置Ф=4.5 mm滤纸片，滤纸片上滴加5 μL无菌过滤液，在培养皿中间接种Ф=4.5 mm的真菌菌丝块，之后于25 ℃、黑暗培养5 d，测量真菌半径，并计算抑菌率。每处理设3次重复，试验重复3次。

抑菌率=（空白对照真菌半径-处理真菌半径）/空白对照真菌半径×100%

1.3 温度对抗菌活性物质的影响

取10 mL无菌过滤液于试管中，将试管分别置于40，60，80，100 ℃水浴中30 min，采用对峙培养法进行抑菌活性测定。每处理设3次重复，试验重复3次。

1.4 紫外线对抗菌活性物质的影响

无菌过滤液置于开盖培养皿中，距紫外灯20 cm处，分别照射5，10，15，20，25和30 min，采用对峙培养法进行抑菌活性测定。每处理设3次重复，试验重复3次。

1.5 蛋白酶对抗菌活性物质的影响

取10 mL无菌过滤液于试管中，分别加入木瓜蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶至终浓度为1 mg·mL-1，在37 ℃水浴中反应2 h，采用对峙培养法进行抑菌活性测定。每处理设3次重复，试验重复3次。

1.6 酸碱对抗菌活性物质的影响

取10 mL无菌过滤液于三角瓶中，分别调pH值至1，3，5，7，9，11，13，静置30 min后，再将pH值调至7，采用对峙培养法对其进行抑菌活性测定。每处理设3次重复，试验重复3次。

1.7 数据分析与统计方法

采用单因素方差分析，并进行F检验。

2 结果与分析

2.1 温度对抗菌活性物质的影响

对峙培养法测定表明，低温处理对Bacillus subtilis B10无菌过滤液抑制A.solani菌丝伸长的影响不明显，但随着温度的升高，影响变得显著，尤其是100 ℃处理30 min后，Bacillus subtilis B10抗菌活性物质对A.solani菌丝生长的抑制作用几乎完全丧失（表1）。

2.2 紫外线照射对抗菌活性物质的影响

通过对A.solani菌丝生长抑制作用进行测定表明，紫外线照射对Bacillus subtilis B10抗菌活性物质抑菌能力的影响不明显，虽然紫外线照射时间不同，其抗菌活性能力略有差异，但均未达到显著水平（表2）。