微型辉光放电等离子体用于质谱成像分析的初步研究

摘 要 本实验利用实验室自主研发的微型辉光放电等离子体（MFGDP）作为离子源解吸样品，使之离子化，得到样品的特征质谱图，经特定软件的转化即可得到对应的图像，图像表明，MFGDP用于质谱成像具有可行性。本方法具有装置简单、操作简易、等离子体羽低温、分析时间短（

关键词 微型辉光放电等离子体； 质谱； 扫描； 成像

1 引 言

质谱成像是一种分子成像技术，但是它不同于需要荧光标记的激光共振聚焦、放射自显影、免疫沉淀等方法，这种方法无需额外标记或分子印染过程就能获得独特、精确的图像，它使成像不局限于某些特异分子，而是面向大多数分子。经过几十年的发展，质谱成像已成为法医、食品分析、地质检测[1～4]等相关领域的重要分析手段，近年来，该技术广泛应用于生物组织及临床研究[5～7]，并取得了较好的成果。质谱成像是将样品的空间信息与其化学信息一一对应，可以对样品x，y二维或x，y，z三维方向顺次扫描，由此获得对应的质谱数据，然后用不同的颜色代表不同组分的空间分布，并通过相关的软件按其空间位置做出质谱影像图。

目前，用于质谱成像的技术根据其工作条件和解吸机制的不同，主要分为以下几类：（1）在真空条件下的基质辅助激光解吸电离（Matrix assisted laser desorption ionization， MALDI）质谱成像技术[8]、二次离子质谱（Secondary ion mass spectrometry， SIMS）[9]等技术；（2）常压下基于喷雾的电离技术， 如解吸电喷雾电离（Desorption electrospray ionization， DESI）[10]、探针电喷雾电离（Probe electrospray ionization， PESI） ＼[11] 等技术；（3）基于激光电离技术，如激光烧蚀电喷雾离子化（Laser ablation electrospray ionization， LAESI）[12]、红外激光消融亚稳诱导化学离子化 （Infrared laser ablation metastable-induced chemical ionization，IR-LAMICI） ＼[13]等技术；（4）基于等离子体的电离技术，如低温等离子体探针（Low temperature probe， LTP）技术[14]、解吸大气压化学电离（Desorption atmospheric pressure chemical ionization， DAPCI）[15]等。近年来，随着医学诊断、地质检测等相关领域的需要，质谱成像技术越来越受到人们的关注，尤其是常压开源质谱成像，该技术主要用于分析分子量低于2000 Da的分子，空间分辨率通常为几十到几百微米[16～18]。基于等离子体的离子化技术由于其本身的限制，用于质谱成像的还较少。由于本实验室研发的微型辉光放电等离子体离子源（MFGDP）[19]具有无污染、高灵敏度、特异性强、高通量等优点，同时又是尺寸小、低温的等离子体，因而在质谱成像方面具有巨大的潜能，基于此，本实验对MFGDP作为离子源用于成像分析作了初步的探索研究，通过对加有尿素的钢笔墨迹以及冬枣切片的扫描，得到了字迹的具体轮廓和切片中不同营养物质硬脂酸和槲皮素衍生物的质谱影像图，并取得了较好的结果，因而为字画研究、艺术品鉴定、营养物质分布图的获取提供了一种新方法。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

LCQ-Fleet型离子阱质谱仪（Thermo Fisher， San Jose， CA），配置Xcalibur （Version 1.4RS1）工作站；载物台、2维电控位移台及步进电机控制器（北京卓立汉光仪器有限公司）；直流稳压电源（扬州双鸿电子有限公司）；质量流量控制器（北京七星电子有限公司）；MFGDP离子源（实验室自主研发）。

碳素钢笔墨水与冬枣均从当地商店购得；分析纯的尿素购自于上海生工公司；普通氩气（99.9%）由侨源气体公司提供。

2.2 实验方法

2.2.1 样品制备 配含有70 μg/mL尿素的碳素钢笔墨水溶液，将钢笔字迹“3”写于陶瓷片，字迹的扫描面积为14 mm×12 mm；用刀片切下约0.5 mm厚的带果皮的冬枣切片，并将切片置于干净的载玻片上直接进行成像分析。

2.2.2 MFGDP的参数及工作条件 MFGDP离子源本体结构参数见原报道[19，20]。工作条件：维持MFGDP离子源的稳定放电电压为1520 V，电流11 mA，氩气流速0.8 L/min；等离子气出口端距电动平移台上的样品约6 mm；离子源与质谱仪进样口距离为约1 cm；样品与质谱仪进样口平齐；MFGDP-MSI的实际工作情况如图1所示；电动位移台的移动速度、移动顺序均由步进电机控制。

2.2.3 质谱条件 MFGDP直接与一台去掉厂方配置离子源的LCQ-Fleet型离子阱质谱仪联用，进行质谱分析检测。 在正、负离子模式下均关闭质谱仪的自动增益（ACG）。 质谱仪参数如下：毛细管温度200℃； 毛细管电压9.5 V； Tube lens 29 V； Multipole RF DAC 320 V； 最大离子注射时间50 ms； 微扫描次数（Microscan）3； 其余参数均为质谱仪的自动调谐值。

2.2.4 数据处理 数据分析时将质谱仪得到的原始raw文件先用imzML Converter软件转化为imzML文件，再通过Datacube Explorer获得最终的质谱影像图。

3 结果与讨论

3.1 质谱成像的可行性评估

为了验证MFGDP离子源用于质谱成像的实用性，本实验对含有70 μg/mL尿素的钢笔墨迹进行了一系列对比分析。对钢笔写下的“3”字进行质谱成像分析，图像的扫描面积为14 mm×12 mm，单个像素点的尺寸为144 μm×150 μm，以尿素的质子化分子离子峰m/z 61作为检测对象，对应的质谱图、质谱成像图和实际样品图如图2所示。

结果表明，质谱成像图中尿素的二维离子分布轮廓图与实际图中分布基本一致，但在质谱图能观察到较为明显的明暗条纹，这可能是由于采用较小的行距引起，其影响因素还需进一步考察并验证。实验可以表明MFGDP离子源用于质谱成像具有实用性，能够提供目标分子在样品中的分布信息及其相对丰度。

3.2 MFGDP-MSI的条件优化

与其它的等离子体常压解吸源测试样品一样，用MFGDP离子源直接扫描样品时仪器工作参数的设定会直接影响质谱信号的强弱，进而影响成像的质量。为了优化实验参数，继续对含有70 μg/mL尿素的钢笔字迹进行对比分析，在MFGDP离子源本身结构参数确定的条件下，MFGDP离子源工作电流、工作气的流速、样品与等离子体羽尾端之间的距离、样品与质谱仪入口之间的距离、等离子体羽的长短、电动位移台的移动速率、纵向间隔都会影响MFGDP-MSI的分辨率。本实验中MFGDP离子源工作电流、工作气的流速、样品与等离子体羽之间的距离、样品与质谱仪入口之间的距离、等离子体羽的长短都采用了MFGDP离子源做质谱分析时的最优条件[19]，通过对影响质谱信号的其它参数的优化，选择了最优体系，结果表明，电动位移台的移动速率、纵向间隔对图案的轮廓清晰度以及纵向分辨率的影响最大。通过初步研究探索，确定电动位移台的最佳水平移动速率为0.3 mm/s，纵向间隔dy为0.4 mm。由最佳条件下钢笔墨迹“A”的影像图（图3）可见，影像图与实际图的轮廓一致，且清晰度较高。

3.3 实际样品分析

以冬枣切片为分析对象，研究不同营养物质硬脂酸和槲皮素在枣内的分布情况。用刀片切下厚约0.5 mm的带果皮的冬枣切片，并置于干净的载玻片上直接扫描，扫描面积12 mm×11.2 mm，在最佳条件下，扫描总时间不超过20 min。图4为冬枣切片的实际样品图、以硬脂酸和槲皮素为目标离子的质谱成像图。从图4可见，整个冬枣切片中都含有硬脂酸，但主要分布于果肉中，而槲皮素主要以其衍生物的形式多存在于果皮中。

3.4 实验结果讨论

从“A”字的成像图中可以看出，成像图虽与实际图较符合，但还是存在明显的拖尾现象，其主要是受等离子体羽本身的形状、尺寸大小的限制，也可能与质谱仪的记忆效应有关。在冬枣的成像图中，观察到有明显黑白相间的宽条纹，主要因为MFGDP产生的等离子羽在x轴方向为薄片而在y轴方向相对较厚。初步实验证明，MFGDP质谱成像在不需要对分析物标记，也不需要对分析样品复杂预处理的前提下，不仅能提供样品中目标物质的空间分布，还能提供其分子的结构信息；更重要的是，因其整个扫描过程具有耗时短、操作简易、等离子体羽低温等特点，使其有望成为生物化学、药物定位、刑侦鉴定等领域的有力工具。目前其空间分辨率还不是很理想，本实验中分辨率大约为300 μm，主要受到了MFGDP离子源本身的制约，还需进一步调整MFGDP离子源的结构，现阶段我们正在改进放电通道的结构， 以得到尺寸更小的等离子体羽。

4 结 论

利用新型MFGDP离子源与常规离子阱质谱仪联用实现了对不同样品的成像分析， 此方法无需复杂的预处理，具有无污染、耗时短、特异性强等优点，比较适合定位小分子物质在组织样品中的分布。经初步探索研究，虽取得较好的结果，但目前其空间分辨率、灵敏度还有待进一步提高，还需进一步调整MFGDP离子源本身的参数，通过改进MFGDP的结构和设计可以获得更微型化的等离子羽，从而进一步提高成像的分辨率。

References

1 Nemes P， Vertes A. TRAC-Trend. Anal. Chem.， 2012， 34： 22-34

2 Handberg E， Chingin K， Wang N， Dai X， Chen H. Mass Spectrom. Rev.， 2015， 34 （6）： 641-658

3 Vickerman J C. Analyst.， 2011， 136. 2199-2217

4 Pacholski M L， Winograd N. Chem. Rev.， 1999， 99 （10）： 2977-3006

5 Bennet R V， Gamage C M， Fernández F M. J. Vis. Exp.， 2013， （77）： 50575

6 XIONG Xing-Chuang， FANG Xiang， OUYANG Zheng， JIANG You， HUANG Ze-Jian， ZHANG Yu-Kui. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（1）： 43-49

熊行创， 方 向， 欧阳证， 江 游， 黄泽建， 张玉奎. 分析化学， 2012， 40（1）： 43-49

7 WEI Kai-Hua， ZHANG Xue-Min， YANG Song-Cheng. J. Instr. Anal.， 2007， S1： 18-20

魏开华， 张学敏， 杨松成. 分析测试学报， 2007， S1： 18-20

8 ZHANG Ying， CHEN Gang， LU Hao-Jie， YANG Peng-Yuan. J. Mass Spectrom. Society， 2008， 28（4）： 209-213

张 莹， 陈 岗， 陆豪杰， 杨M原. 质谱学报， 2008， 28（4）： 209-213

9 Luc V V， Annemie A， Renaat G. Mass Spectrom. Rev.， 1999， 18： 1-47

10 Bennett R V， Gamage C M， Galhena A S， Fernández F M. Anal. Chem.， 2014， 86（8）： 3756-3763

11 Chen L， Yoshimura K， Yu Z， Iwata R， Ito H， Suzuki H， Mori K， Ariyada O， Takeda S， Hiraoka K. Mass Spectrom.， 2009， 44（10）： 1469-1477

12 Nemes P， Vertes A. J. Vis Exp.， 2010， （43）： 2097

13 Galhena A S， Harris G A， Nyadong L， Murray K K， Fernández F M. Anal. Chem.， 2010， 82（6）： 2178-2181

14 Maldonado-Torres M， López-Hernández J F， Jiménez-Sandoval P， Winkler R. J. Proteomics.， 2014， 102： 60-65

15 Li M， Jia B， Ding L， Hong F， Ouyang Y， Chen R， Zhou S， Chen H， Fang X. J. Mass Spectrom.， 2013， 48（9）： 1042-1049

16 Sampson J S， Muddiman D C. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2009， 23： 1989-1992

17 Nemes P， Vertes A. TRAC-Trend. Anal. Chem.， 2012， 34： 22-34

18 Girod M， Shi Y， Cheng J X， Cooks R G. Anal. Chem.， 2010， 83： 207-215

19 Ding X， Zhan X， Yuan X， Zhao Z， Duan Y. Anal. Chem.， 2013， 85（19）： 9013-9020

20 Wang B， Ding X， Zhao Z， Duan Y. Int. J. Mass Spectrom.， 2015， 377： 507-514

21 HUANG Yan-Feng， KANG Yan， WANG Yong-Chan， ZHANG Ping. Stor. Proc.， 2008， 8（6）： 22-24

黄艳凤， 康 妍， 王永婵， 张 平. 保鲜与加工， 2008， 8（6）： 22-24

22 ZHANG Qiong， ZHOU Guang-Fang， SHEN Guang-Ning， ZHU En-Yuan， WANG Hong-Qing. Acta Hort. Sin.， 2010， 2： 193-198

张 琼， 周广芳， 沈广宁， 祝恩元， 王红清. 园艺学报， 2010， 2： 193-198